近年来，随着人们健康意识的提高，结直肠癌的诊断和治疗有显著的提高[1]。但随着治疗进展，结直肠癌耐药的发生率也越来越高。结直肠癌耐药的发生严重影响了治疗效果，严重威胁患者的生存率[2-3]。因此，进一步阐明结直肠癌的耐药机制，寻找新的治疗靶点是目前研究的热点。巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhibition factor，MIF）在肿瘤的发生、发展和转移中发挥重要的促进作用[4-6]。新近的研究[8]表明，MIF与乳腺癌[7]、骨肿瘤等耐药相关，但其是否参与结直肠癌耐药的发生及具体机制鲜有报道。因此，本研究进一步探讨MIF在结直肠癌耐药的作用和机制。
1 材料与方法
1.1 材料
人结直肠癌细胞株L o V o来源本实验室。D M E M培养基（l i f e公司，美国），胎牛血清（Gibco公司，美国）；5-氟尿嘧啶（5-FU）（Sigma公司，美国）；6-磷酸果糖激酶-2/果糖双磷酸酶-2（6-phosphofructo-2-kinase，P F K F B 3）抑制剂P F K-1 5（S e l l e c k公司，中国）；荧光标记的葡萄糖类似物2-N B D G（Thermo公司，美国）；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性检测试剂盒和乳酸（lactate）含量检测试剂盒（Sigma公司，美国）；C C K-8试剂盒（D o j i n d o公司，日本）；MIF抗体（CST公司，美国）；β-actin（proteintech公司，中国）；嘌呤霉素（和元生物，上海），LipofectamineTM 2000 Transfection Reagent（lip-2000，invitrogen，美国）。
1.2 方法
1.2.1 耐药结直肠癌细胞LoVo（LoVo/5-FU）构建 耐药株的构建参考文献[9-11]报道的方法。用含5-FU的培养基（DMEM，含10%胎牛血清）培养LoVo，从5 μmol/L开始，溶度逐渐递增，每2周增加 5 μmol/L，持续 24 周。可见 LoVo在 15 μmol/L 保持稳定生长。
1.2.2 5-FU对结直肠癌细胞LoVo生长抑制曲线建立 参考Wei等[12]方法构建生长抑制曲线。1×104个/孔的结直肠癌细胞LoVo种于96孔板中，12 h后，加入不同溶度的 5-FU（10 μmol/L～1 mmol/L）。孵育 72 h 后，加入 CCK-8 10 μL/孔孵育2 h，酶标仪检测吸光度，描绘生长抑制曲线，计算 IC50。
1.2.3 干预处理 ⑴ MIF的siRNA干扰：si-RNA由上海吉玛生物公司帮忙设计及合成，阴性对照序列：GGC TAC GTC CAG GAG CGC ACC，si-MIF：ACA GGG UCU ACA UCA AUA dTdT。 将 20 μmol si-RNA 和 5 μL lip-2000 混 合 于 100 μL 无 血 清的DMEM中静置15 min后，加入细胞长至70%的6孔板中。12 h后更换含10%胎牛血清的新鲜DMEM，继续培养 48 h，Western blot检测 MIF 蛋白水平。⑵ PFKFB3抑制剂PFK-15处理：PFK-15按终浓度 10 μmol/L预处理细胞 1 h后，再与相应处理。⑶ MIF过表达：过表达MIF蛋白的慢病毒由上海和元生物予构建及合成。1×105/孔细胞种于6孔板中，24 h后加入终滴度为5×106的慢病毒，12 h后更换继续含10%胎牛血清的新鲜DMEM，继续培养48 h，荧光显微镜下观察转染情况。同时给予终浓度为800 μg/L的嘌呤霉素培养1周，观察细胞再无死亡，并荧光显微镜下95%细胞带绿色应该后Western blot检测MIF蛋白表达。
1.2.4 Western blot检测MIF表达 提取全细胞胞浆蛋白，加入5×上样缓冲液，沸水煮10 min后-20 ℃保存。SDS-PAGE 胶分离蛋白（90 V，1.5 h），转膜（冰浴，90 V，2 h），封闭（5%脱脂奶粉，常温，2 h），一抗（1:1 000）4 ℃过夜孵育，二抗（1:5 000）常温 1 h，TBST 5min/次 ×3 次洗膜后ECL显影。
1.2.5 葡萄糖摄取率检测 参考Fischer等[13]的方法，葡萄糖的摄取率通过细胞对2-NBDG摄取量来反映。细胞在无血清条件下培养24 h后更换为含37 kBq/mL 2-NBDG 的低糖 DMEM 继续培养 24 h。消化细胞后留小部分细胞计数，其他用0.5 mol/L氢氧化钠裂解细胞15 min后，加入同体积0.5 mol/L盐酸中和。用液体闪烁计数仪（HIDEX 300SL，芬兰）检测细胞裂解液的dpm值。（LoVo总放射活性-非特异性结合的放射活性）/（细胞数·24 h）即得出LoVo葡萄糖摄取量。
1.2.6 微孔法检测LDH活性 LDH活性检测根据产品说明书（Sigma-Aldrich，MAK066）进行。收集各组细胞1×106，加入100 μL细胞裂解液孵 育 冰 上 10 min 后，13 000 r/min 离 心 10 min去除杂质，收集上清。乳酸溶液、1×的INT溶液、酶溶液等体积混合为工作液。50 μL标准版品（10 milliunits/mL）或样品和 50 μL 工作液等体积混合后加入96孔板中，室温避光孵育30 min，酶标仪490 nm测量样品吸光度。LDH活性=（样品孔吸光度-背景空白对照孔吸光度）/（标准管吸光度-标准空白管吸光度）×标准品浓度。
1.2.7 微孔法检测乳酸水平 乳酸水平检测根据试剂盒说明书（Sigma-Aldrich，MAK064）进行。各组细胞按1×106/孔种于6孔版中，12 h后更换1 mL/孔无血清培养基培养24 h。收集细胞培养基，13 000 r/min 离心 10 min 去除杂质。将 20 μL样品、26 μL乳酸盐测定缓冲液、2 μL乳酸酶混合物和2 μL乳酸盐探针混合，在室温下孵育30 min。酶标仪570 nm测量样品吸光度。用溶度微1 mmol/L的乳酸盐标准物 0、2、4、6、8、10 μL分别加入由26 μL乳酸盐测定缓冲液、2 μL乳酸酶混合物和2 μL乳酸盐探针混合物中建立标准曲线。
1.3 统计学处理
应用SPSS 19.0统计学软件，计量资料以均数±标准差（
±s）表示，采用t检验或方差分析，两两比较用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 耐药结直肠癌细胞LoVo中MIF表达和有氧糖酵解的变化
通过用5-FU培养LoVo 6个月，成功构建对5-FU耐药的结直肠癌LoVo/5-FU细胞，LoVo和LoVo/5-FU对5-FU的IC50分别为0.220和5.600 μmol/L。同时进一步检测MIF蛋白表达和有氧糖酵解情况，结果显示LoVo/5-FU细胞MIF蛋白表达、葡萄糖摄取率、LDH活性、乳酸产生都较LoVo细胞明显升高（均P＜0.05）（图1）。
2.2 下调MIF对LoVo/5-FU耐药和有氧糖酵解的影响
为了解MIF高表达介与LoVo耐药及有氧糖酵解的关系，通过siRNA下调LoVo/5-FU中MIF蛋白表达进一步观察上述指标的变化。结果显示siRNA干扰后，LoVo/5-FU细胞MIF蛋白表达、葡萄糖摄取率、LDH活性、乳酸水平以及对5-FU IC50均明显下降（图2）。
2.3 抑制有氧糖酵解对LoVo/5-FU对5-FU耐药的影响
进一步用P F K-1 5抑制有氧糖酵解，观察LoVo/5-FU对5-FU耐药的变化。结果显示，PFK-15可减少LoVo/5-FU葡萄糖社区了和乳酸水平（均P＜0.05），但对LDH活性影响不大（P＞0.05）；同时，明显减少LoVo/5-FU对5-FU耐药（图3）。
图1 LoVo/5-FU细胞MIF表达和有氧糖酵解的变化 A：细胞生长抑制曲线及细胞对5-FU的IC50；B：Western blot检测MIF蛋白表达及灰度值分析结果；C：糖酵解相关指标检测结果
Figure 1 Changes in MIF expression and aerobic glycolysis in LoVo/5-FU cells A:Cell growth inhibition curves and IC50 values of cells;B:Western blot analysis for MIF protein expressions and results of grayscale intensity analysis;C:Results of detection of glycolysis related markers
图2 下调MIF对LoVo/5-FU耐药和糖酵解的影响 A：Western blot检测MIF蛋白表达与灰度分析结果；B：糖酵解相关指标检测结果；C：细胞生长抑制曲线与IC50
Figure 2 Effects of MIF knockdown on drug resistance and aerobic glycolysis in LoVo/5-FU cells A:Western blot analysis for MIF protein expressions and results of grayscale intensity analysis;B:Results of detection of glycolysis related markers;C:Cell growth inhibition curves and IC50 values
图3 抑制糖酵解对LoVo/5-FU耐药的影响 A：糖酵解相关指标检测结果；B：细胞生长抑制曲线与IC50
Figure 3 Effects of inhibition of aerobic glycolysis on drug resistance of LoVo/5-FU cells A:Results of detection of glycolysis related markers;B:Cell growth inhibition curves and IC50 values
2.4 MIF过表达对LoVo对5-FU耐药的影响及抑制有氧糖酵解的干预作用
为进一步探讨三者的关系，在过表达MIF的LoVo/5-FU细胞上观察以上指标的变化。结果显示，过表达MIF后，LoVo/5-FU细胞MIF蛋白表达、葡萄糖摄取率、LDH活性、乳酸水平和5-FU的IC50均明显增加（均P＜0.05）；加用有氧糖酵解抑制剂PFK-15后，MIF过表达的上述作用除了LDH活性无明显有下降外，其他作用被明显抑制（均P＜0.05）（图4）。
图4 MIF过表达对LoVo对5-FU耐药的影响及同时抑制有氧糖酵解的干预作用 A：Western blot检测MIF蛋白表达与灰度分析结果；B：糖酵解相关指标检测结果；C：细胞生长抑制曲线与IC50
Figure 4 Effects of MIF overexpression on drug resistance of LoVo cells and interventional effects of inhibition of aerobic glycolysis A:Western blot analysis for MIF protein expressions and results of grayscale intensity analysis;B:Results of detection of glycolysis related markers;C:Cell growth inhibition curves and IC50 values
3 讨 论
化疗是结直肠癌治疗的重要手段之一，如何提高化疗疗效和减少肿瘤耐药的能力是目前研究的热点[14-15]。本研究通过5-FU构建耐药的结直肠癌细胞LoVo（LoVo/5-FU），发现其MIF蛋白表达和有氧糖酵解水平都明显增加；而抑制MIF蛋白表达或有氧糖酵解，能显著减少LoVo/5-FU的耐药能力。另一方面，本研究也发现MIF可增加LoVo的有氧糖酵解和对5-FU的耐药能力。
MIF因能抑制单核和巨噬细胞移动而得名。近年来研究[16-18]发现，MIF在肿瘤组织中高表达，其通过促进细胞增殖、抑制凋亡发生和促进血管生成等参与肿瘤的发生发展。进一步的研究[7-8]发现，MIF在肿瘤耐药中也发挥重要作用，MIF可抑制自噬诱导的细胞死亡，进而增加乳腺癌和骨肉瘤等肿瘤的耐药能力。在本研究中发现，在LoVo/5-FU中，MIF的表达较LoVo显著增加；在LoVo中过表达MIF可以增加LoVo对5-FU的耐药；而敲低MIF表达后，LoVo/5-FU的耐药能力被显著抑制。由此说明，MIF是调控结直肠癌耐药的一个重要因子。
MIF是如何调控结直肠癌耐药能力增加的？现有研究[19-21]表明，肿瘤细胞的有氧糖酵解是肿瘤发生发展的重要机制。Ge等[22]发现，有氧糖酵解的关键酶之一PFKFB3可以通过上调乳酸的生成，激活TLR4信号通路，诱导乳腺癌耐药能力增加；而抑制有氧糖酵解也成为减少肿瘤耐药能力的重要手段[23-25]。本研究运用PFKFB3的抑制剂PFK-15处理LoVo/5-FU，减少有氧糖酵解后，发现LoVo/5-FU的耐药能力被明显抑制。同时，本研究也发现，过表达MIF所诱导的LoVo耐药能力的增加可以被PFK-15所抑制。提示，MIF介导的结直肠癌耐药能力增加可能是通过上调结直肠癌有氧糖酵解。
综上所述，MIF介导的有氧糖酵解可能是结直肠癌耐药能力增加的重要机制，是减少直肠癌耐药能力的一个靶点。
参考文献
[1]Aarons CB,Mahmoud NN.现代结直肠癌外科治疗的思考[J].中国普通外科杂志,2015,24(4):459–466.doi:10.3978/j.issn.1005–6947.2015.04.001.Aarons CB,Mahmoud NN.Current surgical considerations for colorectal cancer[J].Chinese Journal of General Surgery,2015,24(4):459–466.doi:10.3978/j.issn.1005–6947.2015.04.001.
[2]Wu DW,Huang CC,Chang SW,et al.Bcl-2 stabilization by paxillin confers 5- fl uorouracil resistance in colorectal cancer[J].Cell Death Differ,2015,22(5):779–789.doi:10.1038/cdd.2014.170.
[3]Arena S,Siravegna G,Mussolin B,et al.MM-151 overcomes acquired resistance to cetuximab and panitumumab in colorectal cancers harboring EGFR extracellular domain mutations[J].Sci Transl Med,2016,8(324):324ra14.doi:10.1126/scitranslmed.aad5640.
[4]Hu CT,Guo LL,Feng N,et al.MIF,secreted by human hepatic sinusoidal endothelial cells,promotes chemotaxis and outgrowth of colorectal cancer in liver prometastasis[J].Oncotarget.2015,6(26):22410–22423.
[5]Abdul-Aziz AM,Shafat MS,Mehta TK,et al.MIF-Induced Stromal PKCbeta/IL8 Is Essential in Human Acute Myeloid Leukemia[J].Cancer Res.2017,77(2):303–311.doi:10.1158/0008–5472.CAN-16–1095.
[6]Dessein AF,Stechly L,Jonckheere N,et al.Autocrine induction of invasive and metastatic phenotypes by the MIF-CXCR4 axis in drug-resistant human colon cancer cells[J].Cancer Res,2010,70(11):4644–4654.doi:10.1158/0008–5472.CAN-09–3828.
[7]Wu MY,Fu J,Xu J,et al.Steroid receptor coactivator 3 regulates autophagy in breast cancer cells through macrophage migration inhibitory factor[J].Cell Res,2012,22(6):1003–1021.doi:10.1038/cr.2012.44.
[8]Liu Y,Zhao L,Ju Y,et al.A novel androstenedione derivative induces ROS-mediated autophagy and attenuates drug resistance in osteosarcoma by inhibiting macrophage migration inhibitory factor (MIF)[J].Cell Death Dis,2014,5:e1361.doi:10.1038/cddis.2014.300.
[9]Sun L,Ke J,He Z,et al.HES1 Promotes Colorectal Cancer Cell Resistance To 5-FU by Inducing Of EMT and ABC Transporter Proteins[J].J Cancer.2017,8(14):2802–2808.doi:10.7150/jca.19142.
[10]颜畅,胡艺冰,穆磊,等.BMP4增强结直肠癌耐药细胞化疗敏感性的作用及机制[J].华中科技大学学报:医学版,2015,44(3):281–284.doi:10.3870/j.issn.1672–0741.2015.03.008.Yan C,Hu YB,Mu L,et al.BMP4 Enhances the Chemosensitivity of Drug-resistant Colorectal Cancer Cells[J].Acta Medicinae Universitatis Scientiae et Technologiae Huazhong,2015,44(3):281–284.doi:10.3870/j.issn.1672–0741.2015.03.008.
[11]文俏程,陈志康,陈子华,等.胃癌细胞奥沙利铂耐药与上皮-间质转化关系研究[J].中国普通外科杂志,2015,24(9):1269–1274.doi:10.3978/j.issn.1005–6947.2015.09.012.Wen QC,Chen ZK,Chen ZH,et al.Relationship between epithelial mesenchymal transition and oxaliplatin-resistance in gastric cancer cells[J].Chinese Journal of General Surgery,2015,24(9):1269–1274.doi:10.3978/j.issn.1005–6947.2015.09.012.
[12]Wei X,Wang W,Wang L,et al.MicroRNA-21 induces 5- fl uorouracil resistance in human pancreatic cancer cells by regulating PTEN and PDCD4[J].Cancer Med,2016,5(4):693–702.doi:10.1002/cam4.626.
[13]Fischer Y,Thomas J,Sevilla L,et al.Insulin-induced recruitment of glucose transporter 4 (GLUT4) and GLUT1 in isolated rat cardiac myocytes.Evidence of the existence of different intracellular GLUT4 vesicle populations[J].J Biol Chem,1997,272(11):7085–7092.
[14]屈雁玲,马俊丽,邓甘露,等.甲基莲心碱逆转人结肠癌细胞奥沙利铂耐药的体外研究[J].中国普通外科杂志,2017,26(3):325–332.doi:10.3978/j.issn.1005–6947.2017.03.009.Qu YL,Ma JL,Deng GL,et al.Reversal effect of neferine on oxaliplatin-resistance in human colon cancer cells in vitro[J].Chinese Journal of General Surgery,2017,26(3):325–332.doi:10.3978/j.issn.1005–6947.2017.03.009.
[15]Yu T,Guo F,Yu Y,et al.Fusobacterium nucleatum Promotes Chemoresistance to Colorectal Cancer by Modulating Autophagy[J].Cell,2017,170(3):548–563.doi:10.1016/j.cell.2017.07.008.
[16]Liu W,Liu SY,He YB,et al.MiR-451 suppresses proliferation,migration and promotes apoptosis of the human osteosarcoma by targeting macrophage migration inhibitory factor[J].Biomed Pharmacother,2017,87:621–627.doi:10.1016/j.biopha.2016.12.121.
[17]D'Amato-Brito C,Cipriano D,Colin DJ,et al.Role of MIF/CD74 signaling pathway in the development of pleural mesothelioma[J].Oncotarget.2016,7(10):11512–11525.doi:10.18632/oncotarget.7314.
[18]Chesney JA,Mitchell RA.25 Years On:A Retrospective on Migration Inhibitory Factor in Tumor Angiogenesis[J].Mol Med,2015,21(Suppl 1):S19–24.doi:10.2119/molmed.2015.00055.
[19]Shang Y,He J,Wang Y,et al.CHIP/Stub1 regulates the Warburg effect by promoting degradation of PKM2 in ovarian carcinoma[J].Oncogene,2017,36(29):4191–4200.doi:10.1038/onc.2017.31.
[20]Jiang SH,Li J,Dong FY,et al.Increased Serotonin Signaling Contributes to the Warburg Effect in Pancreatic Tumor Cells under Metabolic Stress and Promotes Growth of Pancreatic Tumors in Mice[J].Gastroenterology,2017,153(1):277–291.doi:10.1053/j.gastro.2017.03.008.
[21]Jin L,Chun J,Pan C,et al.Phosphorylation-mediated activation of LDHA promotes cancer cell invasion and tumour metastasis[J].Oncogene,2017,36(27):3797–3806.doi:10.1038/onc.2017.6.
[22]Ge X,Cao Z,Gu Y,et al.PFKFB3 potentially contributes to paclitaxel resistance in breast cancer cells through TLR4 activation by stimulating lactate production[J].Cell Mol Biol (Noisy-le-grand),2016,62(6):119–125.
[23]Harada K,Ferdous T,Harada T,et al.Metformin in combination with 5-fluorouracil suppresses tumor growth by inhibiting the Warburg effect in human oral squamous cell carcinoma[J].Int J Oncol,2016,49(1):276–284.doi:10.3892/ijo.2016.3523.
[24]Taniguchi K,Sakai M,Sugito N,et al.PKM1 is involved in resistance to anti-cancer drugs[J].Biochem Biophys Res Commun,2016,473(1):174–180.doi:10.1016/j.bbrc.2016.03.074.
[25]Jin Y,Cai Q,Shenoy AK,et al.Src drives the Warburg effect and therapy resistance by inactivating pyruvate dehydrogenase through tyrosine-289 phosphorylation[J].Oncotarget,2016,7(18):25113–25124.doi:10.18632/oncotarget.7159.
