肝内胆管癌是肝脏常见的恶性肿瘤之一，起源于肝内细小胆管至肝管汇合处的胆管上皮细胞[1-2]，约占原发性肝癌的10%[3]，在过去20年间该病发病率和病死率在全球范围均呈现上升趋势，其病死率在美国印第安和阿拉斯加（0.13%）和亚洲泰国人群（0.14%）中最高，在欧洲人群（0.08%）和非洲人群（0.07%）最低[4-5]。Snail作为上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）过程中重要转录因子，可抑制上皮细胞E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达，诱导细胞发生EMT。EMT是指上皮细胞转化为间质表型细胞，细胞失去上皮细胞表型和极性，细胞之间的粘连逐渐疏松，转化为具有高侵袭和运动能力的间质表型细胞[6-7]，EMT被认为是导致肿瘤局部浸润和远处转移较为常见和重要的原因[8-9]。
本实验研究旨在探讨Snail在肝内胆管癌的表达和临床意义，了解Snail与肝内胆管癌侵袭转移临床病理特征的关系，初步探讨Snail在肝内胆管癌的研究意义，为进一步在体外研究和动物实验研究提供临床数据。
1 材料与方法
1.1 临床资料
临床患者资料来自于昆明医科大学第二附属医院肝胆外科二病区1999年12月—2010年1月期间55例肝内胆管癌患者，均接受根治性手术切除术，取肝内胆管癌肿瘤组织以及邻近的癌旁正常胆管组织，全部患者签署知情同意书，并获昆明医科大学第二附属医院伦理委员会批准；55例患者均无全身远处转移，男28例，女27例；年龄≥70岁者15例，年龄＜70岁者40例；血清CA19-9≥37 ng/mL者30例，CA19-9＜37 ng/mL者25例；血清CEA≥5 ng/mL者40例，CEA＜5 ng/mL者15例；肿瘤单发者42例，多发者13例。TNM分期标准采用国际抗癌联盟（UICC）与美国癌症联合委员会（AJCC）条例。病理组织评分标准采用国际卫生组织条例：肿瘤中低分化者31例，高分化者24例。根据术中所见及术后淋巴结病理检查，有淋巴结转移者29例，无淋巴结转移者26例。术后病检结果均为肝内胆管癌，全部患者术前未接受化疗和放疗。随访日期到2015年1月1日结束，失访6例，平均随访期为（22.6±17.3）（3～60）个月
1.2 免疫组化
临床病理组织采用4%多聚甲醛（上海翊圣生物科技有限公司）固定、石蜡包埋、制做组织切片，90 ℃烤片2 h，二甲苯溶液（上海翊圣生物）浸泡2次各15 min，依次不同浓度乙醇（100%、95%、90%、75%、70%）各5 min，抗原修复采用柠檬酸钠（上海翊圣生物，10 mmol/L，pH 6.0）100 ℃维持10 min，后室温冷却30 min，3%过氧化氢（南京凯基生物）作用20 min阻断内源性过氧化物酶，5%牛血清蛋白（上海翊圣生物）封闭2 h，孵育一抗兔抗Snail单克隆抗体（1:500，英国Abcam公司，货号ab180714），4 ℃过夜，孵育二抗（山羊抗兔二抗，上海翊圣生物科技有限公司）20 min，DAB显色（南京凯基生物），显微镜下控制，苏木素（南京凯基生物）细胞核复染，酒精水化及二甲苯透明，中性树胶（上海翊圣生物）封片，奥林巴斯光学（日本，DP71）显微镜下镜检采集数据。
1.3 免疫组化结果评分
评分方法参考复旦大学中山医院肝癌研究所出版文献标准[10-11]，采用Image pro plus软件分析，综合染色面积和强度评分。染色面积标准：棕色面积＞50%为1分，棕色＜50%位0分。染色强度标准：棕黑色染色为2分，较浅棕色为1分，无染色为0分。结果分别给2名病理科医师观察，染色面积和强度评分相加，总分≥2分认为是高表达，低于2认为是低表达。
1.4 统计学处理
数据处理采用SPSS 21.0软件，计数资料采用χ2检验，癌和癌旁Snail表达比较采用配对t检验。绘制Kaplan-Meier总体生存曲线和累计复发曲线，Log-rank检验分析总体生存率和累计复发率差异，采用Cox回归模型进行多因素生存分析。检验结果取双侧，检验水准α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 Snail在肝内胆管癌的表达及其与临床病理特征的关系
免疫组化法检测55例肝内胆管癌病理组织，结果表明在肿瘤组织中（图1A-B）表达明显高于癌旁组织（图1C-D）；Snail染色主要位于细胞核，在细胞质和细胞膜中未见表达，经免疫组化评分分析肿瘤组织与癌旁组织结果分别为2.764±0.844、0.914+0.765，差异有统计学意义（t=12.575，P＜0.001）（图1E）；其中肿瘤组织高表达率为48.6%（27/55），癌旁组织高表达率为18.0%（10/55），两者间差异有统计学意义（χ2=11.770，P=0.001）（图1F）。
将Snail定量表达与肝内胆管癌病例病理特征相结合分析，结果表明过表达的Snail患者与低表达的Snail患者在淋巴结转移、TNM分期、肿瘤分化、微血管侵犯以及复发之间存在差异（表1）。
图1 Snail表达免疫组化检测结果 A-B：肿瘤组织（×200）；C-D：癌旁组织（×200）；E：Snail相对表达量比较；F：Snail高表达百分比比较
Figure 1 Results of immunohistochemical staining for Snail expressions A–B: Tumor tissue (×200); C–D: Peritumoral tissue (×200);E: Comparison of relative Snailexpression levels; F: Comparison of percentages of high Snail expression
2.2 Snail与55例肝内胆管癌病例生存分析
S n a i l免疫组化染色结果与生存分析结果表明，过表达Snail的病例术后总体生存率较低（P=0.018）（图2A），术后累计复发率较高（P=0.032）（图2B）。单因素总体生存率和累计复发率分析结果表明TNM分期、微血管侵犯淋巴结转移、以及Snail染色可预测肝内胆管癌患者预后（均P＜0.05）（表2）；多因素Cox回归模型分析结果表明微血管侵犯、淋巴结转移以及Snail 表达可是肝内胆管癌患者预后的独立影响因素（均P＜0.05）（表3）。
表1 Snail表达与肝内胆管癌患者临床病理特征的关系分析[n（%）]
Table 1 Analysis results of relations of snail expression with cliniopathologic features ICC patients [n(%)]
参数 n 高表达 低表达 χ2 P 参数 n 高表达 低表达 χ2 P性别 淋巴结转移男28 15（53.6） 13（46.4） 0.458 0.498 有 29 18（66.7） 11（39.3） 4.134 0.042女27 12（44.4） 15（55.6） 无 26 9（33.3） 17（60.7）年龄（岁） TNM分期≥70 15 8（29.6） 7（25.0） 0.149 0.700 III/IV 23 16（59.3） 7（25.0） 6.631 0.010＜70 40 19（70.4） 21（75.0） I/II 32 11（40.7） 21（75.0）血清CA19-9（ng/mL） 肿瘤分化≥37 30 13（48.1） 17（60.7） 0.875 0.349 III/IV 31 19（70.4） 12（42.9） 4.231 0.040＜37 25 14（51.9） 11（39.3） I/II 24 8（29.6） 16（57.1）血清CEA（ng/mL） 微血管侵犯≥3.4 40 21（77.8） 19（67.9） 0.682 0.409 有 33 22（81.5） 11（39.3） 10.197 0.001＜3.4 15 6（22.2） 9（32.1） 无 22 5（18.5） 17（60.7）最大肿瘤直径（cm） 复发≥5 41 21（77.8） 20（71.4） 0.292 0.589 有 32 24（88.9） 18（64.3） 4.610 0.032＜5 14 6（22.2） 8（28.6） 无 13 3（11.1） 10（35.7）肿瘤数目多发 13 6（22.2） 7（25.0） 0.059 0.808单发 42 21（77.8） 21（75.0）
图2 Snail表达与患者生存的关系 A：总体生存率；B：累计复发率
Figure 2 Relation of Snail expression and survival of the patients A: Overall survival rate; B: Cumulative recurrence rate
表2 单因素总体生存率和累计复发率分析结果
Table 2 Univariate analysis of factors for overall survival and cumulative recurrence rates
因素 总体生存率 累计复发率HR（95% CI） P HR（95% CI） P性别（男vs.女） 1.189（0.661～2.139） 0.564 1.378（0.770～2.467） 0.280年龄（＜53岁vs.≥53岁） 1.192（0.663～2.141） 0.557 1.246（0.698～2.224） 0.457血清CA19-9（＜37 ng/mL vs.≥37 ng/mL） 0.829（0.458～1.502） 0.537 0.809（0.451～1.452） 0.477血清CEA（＜5 ng/mL vs.≥5 ng/mL） 1.173（0.644～2.137） 0.602 1.397（0.771～2.531） 0.271 TNM分期（I/II vs.III/IV） 0.415（0.224～0.769） 0.005 0.411（0.221～0.764） 0.005肿瘤分化（I/II vs.III/IV） 0.796（0.443～1.430） 0.445 0.946（0.529～1.689） 0.851微血管侵犯（是vs.否） 0.396（0.206～0.761） 0.005 0.430（0.224～0.852） 0.011最大肿瘤直径（≤5cm vs.＞5cm） 0.803（0.397～1.625） 0.542 0.655（0.330～1.300） 0.226肿瘤数目（单发vs.多发） 0.570（0.238～1.365） 0.207 0.441（0.182～1.068） 0.070淋巴结转移（是vs.否） 0.412（0.220～0.773） 0.006 0.490（0.263～0.913） 0.025 Snail表达（高vs.低） 0.451（0.265～1.349） 0.008 0.272（0.204～0.989） 0.003
表3 多因素Cox回归模型分析结果
Table 3 Analysis results of multivariate Cox regression model
因素 总体生存率 累计复发率HR（95% CI） P HR（95% CI） P微血管侵犯（是vs.否） 0.520（0.311～0.869） 0.023 0.562（0.338～0.934） 0.026 TNM分期（I/II vs.III/IV） 0.649（0.374～1.126） 0.124 0.551（0.314～0.968） 0.038淋巴结转移（是vs.否） 0.713（0.443～1.148） 0.003 0.670（0.430～1.070） 0.024 Snail表达（高vs.低） 0.860（0.464～1.310） 0.012 0.818（0.453～1.608） 0.011
3 讨 论
肝内胆管癌作为一种侵袭性较强的恶性肿瘤，预后较差、有效治疗措施有限[12-13]，高侵袭和转移是其导致死亡的最主要原因之一[12]，选取合理有效的分子标记物评估肝内胆管癌患者预后与早期复发，对肝内胆管癌患者具有重要的临床治疗指导意义，大量研究[14-16]证实EMT可促进肿瘤细的胞侵袭和转移能力，而在EMT过程中Snail作为关键的转录因子[17]，其可促进肿瘤EMT致使肿瘤细胞侵袭和转移能力大大提高，诱发肿瘤细胞远处转移[18-19]。
核转录调节因子S n a i l，能够结合到E-cadherin基因DNA中启动子区域[20]以及通过表观遗传学修饰[21]抑制E-cadherin的表达，诱导细胞EMT，在众多促进肿瘤侵袭的研究中表明，不同的分子通过不同的信号通路导致Snail因子异常增加，可加速肿瘤细胞EMT的发生，Ke等[22]在CD151分子对肝细胞肝癌的肿瘤侵袭转移研究中，发现CD151可通过PI3K/Akt/Snali信号通路促进肿瘤细胞EMT；此外在体外肝内胆管癌细胞研究中，采用RNA干扰技术沉默Snail蛋白表达后细胞侵袭转移能力减低[11]；吴天山等[23]对胰腺癌患者行病理标本免疫组化染色，结合随访资料分析Snail与EMT指标密切相关，是胰腺癌转移相关的重要指标。本研究结果表明，Snail在肝内胆管癌病理组织中呈现过表达，临床病理特征分析结果表明过表达的Snail与侵袭转移病理特征相关，结合既往研究，笔者推测Snail在肝内胆管癌中过表达可能会诱导肿瘤细胞EMT改变，致使肿瘤细胞侵袭和转移能力增加，这为目前肿瘤的分子靶向提供了部分临床数据，当靶向沉默Snail后可能会降低细胞侵袭转移能力，缓解患者的远处转移和肿瘤复发，为患者带来新的治疗机会。
在Snail临床随访研究中，Kong等[24]对44例肝门部胆管癌进行了临床随访研究，结果表明Snail可预测较差的预后，作为预后指标；在103例胃癌病例的临床随访研究中，结果表明Snail能够作为一种合理的预后因子预测胃癌的进展，并可作为胃癌的干预靶点之一[25]。在此，我们的随访生存分析结果表明，过表达的Snail肝内胆管癌患者中，其术后总体生存率较低，且过表达Snail患者的术后累计复发率较高，在单因素分析和多因素Cox回归模型分析结果表明Snail染色可作为预测肝内胆管癌患者预后的指标，这与Snail在其他肿瘤中的研究结果类似，这对指导患者术后常规进行Snail免疫组化染色评估肝内胆管癌患者的预后具有重要的意义，为早期进行生物治疗提供有力的数据，同样为降低患者术后复发率和病死率都提供有力的支持。
综上所述，本研究实验结论为Snail在肝内胆管癌中表现为过表达，过表达的Snail与肝内胆管癌侵袭转移临床病理特征相关，虽Snail的具体作用机制需要我们更深层次的探索，但根据本研究结果推断，Snail有可能做为预测肝内胆管癌患者预后因子，并可望作为生物治疗的作用靶点。
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