甲状腺疾病主要包括甲状腺激素分泌异常以及甲状腺腺体细胞异常增生性疾病，近年来随着环境污染、结节性甲状腺肿以及毒性弥漫性甲状腺肿大等甲状腺疾病发生率的增加，甲状腺癌的发生率维持在较高的水平。甲状腺癌病理类型主要包括乳头状癌、髓样癌以及未分化癌等，根据不同的上皮来源以及临床分期进行根治性肿瘤切除术，是治疗甲状腺癌的主要方式[1-3]。对于甲状腺癌术后随访的研究发现，患者术后5年生存率、无瘤生存率以及术后中位生存时间等影响因素较为复杂，临床上迄今尚无公认的肿瘤免疫学指标或者基因学标记进行预后判断。甲状腺癌细胞间黏附性以及转移侵袭能力的调控在肿瘤早期转移以及术后复发等方面发挥了重要的作用[4-6]，探讨乳腺癌转移抑制因子（BRMSl）、细胞缝隙连接蛋白43（Cx43）在甲状腺癌中的表达变化，有助于揭示其在甲状腺癌预后以及病因学研究中的潜在价值。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取本院病理科收集的术后确诊甲状腺癌患者的组织标本（甲状腺癌组）102例、因外科其他原因进行甲状腺活检或手术采集的正常甲状腺组织标本40例（正常组）、手术后确诊为甲状腺良性疾病67例（良性组，包括甲状腺腺瘤、结节性甲状腺肿）。甲状腺癌组102例患者，其中男38例，女64例；年龄33～76岁，平均年龄（43.0±11.2）岁；侵犯包膜34例。病理类型：乳头状癌34例，滤泡癌28例，髓样癌28例，未分化癌12例；发生淋巴结转移44例。TNM分期：I期21例，II期35例，III期29例，IV期17例；肿瘤直径：≥4cm 28例，＜4cm 74例。正常组40例，其中男15例，女25例；年龄31～72岁，平均年龄（41.5±15.9）岁。良性组67例，中男24例，女43例；年龄28～70岁，平均年龄（40.2±13.9）岁，其甲状腺腺瘤3 1例；结节性甲状腺肿3 6例。三组研究对象的一般资料差异无统计学意义（P＞0.05）。
纳入标准：⑴ 甲状腺癌标本来源于本院手术后标本经病理学证实的患者，正常组、良性组来源于因外科原因手术或病理活检证实的甲状腺组织；⑵ 甲状腺癌患者术前未接受放疗、化疗等其他治疗措施；⑶ 纳入研究对象的临床资料完整。排除标准：⑴ 未经证实的甲状腺癌患者；⑵ 淋巴瘤等其他恶性肿瘤患者，隐匿性乳腺癌患者；⑶ 各项资料不完整，不能进行统计分析及预后观察的甲状腺癌患者。
1.2 免疫组化方法
组织采用石蜡包埋，切片机切取组织，厚度5 mm，用多聚赖氨酸处理。在脱蜡之前，将切片置于60 ℃恒温箱中烘烤60 min。将切片用二甲苯浸泡10 min，更换二甲苯后再浸泡10 min。水化后进行抗原修复，3%H2O2一甲醇溶液处理切片15 min，加入一抗鼠单抗100 μL，37 ℃，湿盒孵育1 h。加入增强剂50 μL，室温湿盒孵育20 min。加入HRP标记二抗50 μL，室温37 ℃，孵育30 min。每张片子加2滴新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察。
1.3 观察标准
免疫组化结果判断：BRMSl、Cx43蛋白定位于细胞核和细胞质内，阳性着色表达呈黄色、棕黄色、褐色表达，每一张切片选取10个高倍镜视野（400倍），计数每100个甲状腺细胞中阳性细胞的表达率及着色强度；⑴ 根据着色强度：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为褐色、黑色；⑵ 根据阳性细胞比例：阳性细胞数目所占比例＜5%为0分，阳性细胞所占比例5%～25%为1分，阳性细胞数26%～50%为2分，阳性细胞数50%～75%为3分、阳性细胞数所占比例＞75%为4分，两种积分之和总分≤分为阴性、≥3分为阳性。
1.4 随访资料收集
对患者进行为期5年的随访，随访方法主要为电话或在患者主动到医院接受复查，主要观察患者的生存情况、肿瘤复发情况。
1.5 统计学处理
数据分析及统计在专业软件SAS9.0软件包中处理，计量指标采用均数±标准差
表示，计数资料采用百分率或构成比（%）表示，比较采用χ2检验；P＜0.05表示差异具有统计学意义。
2 结 果
2.1 三组组织标本中的BRMSl、Cx43蛋白阳性表达情况比较
BRMSl以及Cx43的表达在良性组和正常甲状腺组明显强于甲状腺癌组织，BRMSl以及Cx43免疫组化染色可见其主要分布与良性组织的病变上皮内，BRMSl聚集于细胞核或者细胞质内，染色较为均一；而甲状腺癌组织中的表达较弱，染色较浅，在异型性较强的部位BRMSl仅有少量可以染色，Cx43染色可见其主要位细胞核和细胞质内（图1-2）。
图1 BRMSl蛋白的免疫组化染色（SP×200） A：甲状腺癌组织中BRMSl蛋白阴性表达；B：甲状腺癌组织中BRMSl蛋白阳性表达
图2 Cx43蛋白的免疫组化染色（SP×200） A：甲状腺癌组织中Cx43蛋白阴性表达；B：甲状腺癌组织中Cx43蛋白阳性表达
甲状腺癌组织中BRMSl、Cx43蛋白的阳性表达率分别为49.02%、46.07%，均明显低于良性组和正常组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）（表1）。
表1 BRMSl、Cx43蛋白阳性表达情况比较[n（%）]
组别 n BRMSl蛋白 Cx43蛋白阳性 阴性 阳性 阴性甲状腺癌组 102 50（49.02）52（50.98）47（46.07）55（53.92）良性组 67 61（91.04）6（8.96） 65（97.01）2（2.99）正常组40 38（95.00）2（5.00）40（100.00）0（0.00）χ2 48.48 71.446 P＜0.001 ＜0.001
2.2 甲状腺癌组织中BRMSl、Cx43蛋白阳性表达与患者的临床病理特征的关系
甲状腺癌组织中BRMSl、Cx43蛋白的阳性表达率与患者发生淋巴结转移、包膜侵犯、肿瘤直径、TNM分期有关（均P＜0.05）；与患者的年龄、性别、病理类型无关（均P＞0.05）（表2）。
表2 BRMSl、Cx43蛋白阳性表达与患者的临床病理特征的关系[n（%）]
临床病理特征 n BRMSl蛋白 χ2 P Cx43蛋白 χ2 P年龄（岁）＜45 54 30（55.56） 1.962 0.161 28（51.85） 1.539 0.215≥ 45 48 20（41.67） 19（39.58）性别男38 22（57.89） 1.909 0.167 20（52.63） 1.047 0.306女64 28（43.75） 27（42.19）病理类型乳头状癌 34 18（52.94）0.219 0.772 16（47.06）滤泡癌 28 13（46.43） 13（46.43）髓样癌 28 14（50.00） 13（46.43）未分化癌 12 5（41.67） 5（41.67）淋巴结转移是0.092 0.896 44 13（29.55） 11.743 0.001 14（31.82） 6.333 0.012否58 37（63.79） 33（56.90）包膜侵犯是34 10（29.41） 7.846 0.005 9（26.47） 7.892 0.005否68 40（58.82） 38（55.88）TNM分期I+II期 56 35（62.50） 9.029 0.003 36（64.29） 16.568 ＜0.001 III+IV期 46 15（32.61） 11（23.91）肿瘤直径（cm）≥4 28 7（25.00） 8.91 0.003 5（17.86） 12.371 ＜0.001＜ 4 74 43（58.11） 42（56.76）
2.3 甲状腺癌组织中BRMSl、Cx43蛋白阳性表达与患者预后关系
BRMSl蛋白阳性表达的患者50例，5年复发2例（4.0%），无患者死亡；阴性表达患者52例，5年死亡5例（9.62%），复发5例（9.62%），C x 4 3蛋白阳性表达的患者4 7例，5年复发1例（2.13%），无患者死亡；阴性表达患者55例，5年死亡5例（9.1%）、复发6例（10.9%），甲状腺癌组织中BRMSl、Cx43蛋白阳性表达患者的5年复发、病死率均明显低于阴性表达患者（均P＜0.05）（表3）。
表3 BRMSl、Cx43蛋白阳性表达与患者预后
n 复发、病死率[n（%）]BRMSl蛋白阳性 50 2（4.00）阴性 52 10（19.23）χ2 7.554 P 0.006 Cx43蛋白阳性 47 1（2.13）阴性 55 11（20.00）χ2 11.376 P 0.001
3 讨 论
对于不同病理类型的甲状腺癌病灶，通过硬膜外麻醉下或者全麻气管插管下进行不同的手术方式是目前临床上标准手术方式，患者甲状腺淋巴结局部转移、对侧甲状腺峡叶以及远处转移情况均为甲状腺癌术前常规评估指标。在切除病变侧部位的同时，注意避免喉返神经以及喉上神经等损伤，降低术后并发症的发生。然而多数学者[7-9]认为采用中华普外科协会对于甲状腺疾病的诊治指南中关于甲状腺癌预后参考指标的评估后，并未发现甲状腺癌患者术后生存时间的延长。基础领域研究[10-11]表明，甲状腺癌的早期转移以及淋巴结侵袭机制的研究对于改善根治性手术术后生存具有显著性的指导意义，肿瘤的早期基底膜突破、细胞间黏附以及间质成分的分解等对于甲状腺癌的发生发展具有重要价值[12-13]。早期研究[14-15]表明BRMSl参与到了乳腺癌的淋巴结转移以及乳腺小叶的侵袭过程，随着研究的进展，在肝癌以及卵巢癌等病变组织中BRMSl也呈现异常表达，但表达阳性率不一，Cx43通过维持细胞间连接的稳定性，进而参与到细胞增殖调控、凋亡以及细胞间信号以及刺激的传递等[16-18]。目前对于Cx43以及BRMSl在甲状腺癌中的表达以及其与相关临床特征间关联的分析研究应该得到关注。
笔者观察到正常甲状腺组织以及良性病变如单纯性甲状腺肿等组织中BRMSl以及Cx43的表达明显强于甲状腺癌组织，BRMSl以及Cx43免疫组化染色可见其主要分布与良性组织的病变上皮内。BRMSl聚集于细胞核或者细胞质内，染色较为均一，而甲状腺癌组织中的表达较弱，染色较浅，在异型性较强的部位BRMSl仅有少量可以染色，Cx43染色可见其主要位细胞核和细胞质内。BRMS1 抑制肿瘤转移途径可通过调控上游起始转录位点、维持染色体末端的羟基稳定性等实现，而其中对于细胞间缝隙连接通讯的调控可影响细胞间连接蛋白Cx43的表达，进而影响细胞间信号传递并诱导临近细胞的分化以及增殖，提示了两者者在甲状腺癌发生发展中的协同作用。对于BRMSl以及Cx43与甲状腺癌临床特征的关系研究发现，发生淋巴结转移、包膜侵袭以及淋巴节转移的甲状腺癌患者的BRMSl以及Cx43的表达更弱，阳性率更低，BRMSl对于AKT/NOTCH/CYC信号通路的激活可以调控p16以及、p56的表达，并抑制G0期甲状腺上皮细胞进入G1期或者S，降低处于分裂期上皮的比例[19-24]，BRMSl表达的降低抑制了其对于甲状腺上皮细胞的增殖调控作用，促进了其侵袭转移。
Maloberti等研究者[25-27]通过基础研究表明，BRMSl mRNA表达的降低与Cx43蛋白表达的下降具有正性相关关系，两者的下调可促进甲状腺癌临床分期的进展，进而导致远期生存指标如中位生存时间等的下降。III+IV期的甲状腺癌患者其BRMSl以及Cx43表达不足30%，显著低于I+II期甲状腺癌患者。有研究[28-30]证实甲状腺未分化癌组织中BRMS1蛋白水平和甲状腺癌患者的复发转移间有一定的相关性。本研究进行复发率的分析发现甲状腺癌组织中BRMSl、Cx43蛋白阳性表达患者的5年复发、病死率均显著的低于阴性表达患者，BRMSl、Cx43蛋白表达的缺失，可以导致患者远期生存指标的恶化，其机制考虑可能与BRMSl、Cx43蛋白的下降失去了其对于细胞周期的调控能力有关，但具体的机制仍然需要进一步探讨。
BRMSl、Cx43在甲状腺癌组织中异常表达，其蛋白水平表达的减弱与病变的侵袭以及转移具有显著的相关关系，同时BRMSl以及Cx43的动态随访有利于甲状腺术后的长期随访。
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