动脉狭窄性疾病的治疗理念处于不断更新中，但自体静脉移植，仍然是重建冠脉及外周动脉的主要方式[1-2]。移植静脉狭窄（vein graft stenosis，VGS）限制了其远期疗效。但是，VGS的确切机制尚未阐明[3]。之前关于VGS的研究都基于一个假设：移植静脉的内膜增生，同动脉损伤后的内膜增生，具有相似的病理生理过程[4-6]。但是，基于上述思路的临床实验并未改善移植静脉的远期通畅率[7-8]。
发育生物学研究提示：胚胎期，循环系统建立之初，动脉与静脉就存在基因水平的差异[9]。ephrinB2及其受体EphB4这一对分子标记物是血管形成过程中动、静脉分化的决定性分子，促使初期脉管分别向动脉、静脉分化。在成年动物，两者分别分布于动脉、静脉的内皮细胞，维持成年动物动、静脉的结构及功能稳定，是动、静脉的分子指纹[10]。
前期研究[5, 11]提示：移植静脉适应动脉血流的过程具有其静脉特异性，可能与动脉损伤后的狭窄存在分子水平的差异。本研究采用成组设计，观察不同EphB4表达量对移植静脉吻合口管腔、内皮细胞迁移能力、ERK1/2（细胞外信号调节激酶途径）通路活化的影响，探索EphB4相关、静脉特异性的适应动脉血流的调控机制，从全新的视野为VGS的防治提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 动物实验
1.1.1 实验动物 成年雄性野生型SD大鼠50只，体质量220～300 g，由昆明医科大学SPF实验中心提供。成年雄性EphB4+/-型转基因SD大鼠10只，体质量220～300 g，由广州赛业生物科技有限公司制备，昆明医科大学SPF实验中心繁育。大鼠均在“昆明医科大学实验动物饲养与操作规程”规范下进行实验操作。
1.1.2 移植静脉模型建立 2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，供体大鼠行胸部正中切口，剪取上腔静脉约2 cm，置于肝素生理盐水中备用。受体大鼠行腹部正中切口，暴露大鼠腹主动脉及下腔静脉并肝素化，血管夹阻断主动脉近远端血流，离断腹主动脉，将供体上腔静脉以端端吻合方式，移植到受体腹主动脉，重建动脉血流[12]。
1.1.3 分组及处理 单纯模型组：随机选择野生型大鼠20只（供体、受体各10只），建立移植静脉动物模型；EphB4增强组：将ephrinB2-Fc溶于PluronicF127胶与阳离子聚合物PEI的混合液中，配置为1 µg/mL；随机选择野生型大鼠20只（供体、受体各10只），建模后取混合物200 μL涂抹于移植静脉外膜[4]；EphB4减弱组：随机选野生型大鼠10只，EphB4+/-型大鼠10只，将EphB4+/-型转基因大鼠静脉行端端吻合，移植到野生型大鼠腹主动脉。按取材时间不同，各组内再分为术后1周组及术后4周组。
1.1.4 标本的收集与处理 过量麻醉处死大鼠后，切取移植静脉，置于4%多聚甲醛中过夜，石蜡包埋，制片备用。分别行：HE染色、α-平滑肌肌动蛋白（α-actin）免疫组织化学染色、Masson染色，并测量移植静脉内膜+中膜厚度。
1.2 细胞实验
1.2.1 细胞来源 野生型大鼠静脉内皮细胞取自大鼠上腔静脉，EphB4+/-型大鼠静脉内皮细胞取自EphB4+/-型大鼠上腔静脉。
1.2.2 干预措施 以相同浓度的ephrinB2-Fc分别刺激野生型及EphB4+/-型静脉内皮细胞进行qRT-PCR对比两种细胞EphB4 mRNA的表达，进行Western blot对比两种细胞p-ERK1/2、磷酸化EphB4膜受体（p-EphB4R）表达的异同，进行免疫荧光、细胞划痕实验。
1.3 实验试剂
大鼠ephrinB2-Fc蛋白购于Sino-biological公司，α-actin单克隆抗体、EphB4单克隆抗体，免疫组化染色试剂盒，免疫荧光染色试剂盒，PCR试剂盒等，均购于Cell signaling technology公司。
1.4 具体实验方法
HE染色，平滑肌细胞特异性染色（α-actin）及胶原纤维特异性染色Massion染色，由云南省阜外心血管病医院病理科按相关操作规程进行。RT-PCR、Western blot、免疫荧光染色均按相关试剂盒操作规程完成。α-actin及Massion染色结果判定：在光强度及曝光度相同的条件下，每例切片在10×40光学显微镜下任选5个视野，测定其阳性颗粒的平均光密度值（optical density，OD），以此代表免疫组化阳性细胞的量。荧光染色结果判定：依照细胞阳性着色程度，可分为：弱阳性（+）1分；中等阳性（++）2分；强阳性（+++）3分。采用积分综合计量。计算公式为：（+）%×1+（++）%×2+（+++）%×3；总数值＜0.5者为（-），＜1.0者为（+），1.0～1.5者为（++），＞1.5者为（+++）；至少随机观察5～10个视野。细胞划痕实验：培养内皮细胞，中央区域划线，不同时间观察周边细胞是否移动至中央划痕区，以此判断细胞迁移能力。
1.5 图像分析及统计学处理
应用NIH Image J医学图象分析系统对免疫组化染色后的图像进行定量分析。数据以均数±标准差（
±s）表示，应用SPSS 22.0统计软件分析，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 组织病理学结果
建模成功后1、4周取材（共4组，n=5）。通过HE染色测量内膜+中膜厚度（图1），结果提示：与正常上腔静脉比较，各实验组移植静脉的内膜+中膜厚度均明显增加（均P＜0.05）；术后1周，各实验组组间内膜+中膜厚度差异无统计学意义（P＞0.05）；术后4周，各组内膜+中膜厚度组间比较出现明显差异（P＜0.05）。其中，ephrinB2增强组内膜+中膜厚度明显低于模型组，而EphB4减弱组内膜+中膜厚度明显高于ephrinB2增强组（均P＜0.05），但EphB4减弱组与模型组间差异未达统计学意义（P＞0.05）。α-actin及Massion染色结果显示：术后4周，ephrinB2干预组α-actin阳性细胞及胶原纤维表达，明显低于对照组，而EphB减弱组则高于ephrinB2增强组（图1）（表1）（均P＜0.05）。
图1 大鼠正常上腔静脉与术后4周各组移植静脉标本染色结果（×100）
Figure 1 Staining results of the normal rat superior vena cava and the vein graft s od each experimental group at 4 weeks aft er model creation（×100）
表1 大鼠正常上腔静脉与各实验组内膜+中膜厚度、α-actin及胶原纤维含量比较（
±s）
Table 1 Comparison of the intima-media thickness,and the contents of smooth muscle actin and collagen fiber among normal rat superior vena cava and the experimental groups（ ±s）
注：1）与正常上腔静脉比较，P＜0.05；2）与同组术后1周比较，P＜0.05；3）与EphB4增强组比较，P＜0.05
Note:1）P＜0.05 vs. normal rat superior vena cava; 2）P＜0.05 vs. same group at 1 week aft er model creation; 3）P＜0.05 vs. EphB4 enhancing group
2.2 磷酸化水平检测结果
相同浓度ephrinB2-Fc（1 μg/mL）分别刺激野生型（EphB4+/+）及EphB4+/-型静脉内皮细胞，免疫荧光与Western blot结果均显示，EphB4+/-型静脉内皮细胞ERK1/2、EphB4R磷酸化程度弱于野生型（图2）；qRT-PCR结果显示，EphB4+/-型静脉内皮细胞的EphB4 mRNA转录活性明显低于野生型（P＜0.05）（图3）。
2.3 细胞迁移能力检测结果
细胞划痕实验结果显示，两种内皮细胞在同等条件、相同浓度ephrinB2-Fc（1 μg/mL，6 h）刺激下，EphB4+/-型静脉内皮细胞迁移程度明显低于野生型（P＜0.05）（图4）。
图2 野生型与EphB4+/-型大鼠静脉内皮细胞ERK1/2、EphB4R磷酸化程度比较
Figure 2 Comparison of the degrees of phosphorylation of EphBR and ERK1/2 between vein endothelial cells from wild type and EphB4+/- type rats
图3 野生型与EphB4+/-型大鼠静脉内皮细胞mRNA转录活性比较
Figure 3 Figure 2 Comparison of the transcriptional activityies of EphB4 mRNA between vein endothelial cells from wild type and EphB4+/- type rats
图4 细胞划痕实验结果
Figure 4 Results of scratch-wound assay
3 讨 论
无论是静脉移植重建动脉[13]，还是血管介入治疗腔内重建动脉[14-15]，其共同的瓶颈就是术后再狭窄。这一问题一直是心血管病内、外科医生面临的重要挑战，此过程所特有的复杂机制尚无任何学说能够做出清楚的解释。
动脉术后再狭窄的共同通路是：血管内膜高度增生[16-17]。由于动、静脉的内膜增生有着相似的病理生理过程和临床结局，过去的研究都是基于同一个假设，也就是动、静脉的内膜增生拥有共同机制。处理动脉内膜增生的治疗策略，同样被应用于处理移植静脉的内膜增生。可以概括为：利用不同载体，将不同的治疗因子转染致静脉移植物管壁，或直接利用药物涂层支架[18]或者涂层球囊[19]，改善静脉移植物或介入治疗后动脉的远期通畅率，但是运用于临床，未能达到预期的治疗效果。
基于发育生物学及课题组前期研究结果[20-21]，本研究的假设是：成年动物，静脉具有可塑性，静脉分子指纹EphB4的表达量，可能是移植静脉内膜增生的核心调节因子。保证EphB4的表达，可维持静脉结构及功能的“稳态”，可能将减少移植物的内膜增生及管腔狭窄。研究从动物实验和细胞实验两方面验证了假设。静脉移植术后4周，EphB4增强组的内膜+中膜厚度，平滑肌细胞增殖程度均较EphB4减弱组及模型组显著减少。从组织学层面提示EphB4表达量的差异对内膜增生的影响。细胞学研究进一步验证EphB4表达量不同时，EphB4膜受体磷酸化，下游传导通路ERK1/2的激活程度不同。划痕实验模拟了内皮细胞的迁移，EphB4+/-型静脉内皮细胞迁移程度显著低于野生型，推测基因敲除后的内皮细胞功能弱化。虽然细胞实验不能完全反映动物实验中内膜增生及管壁重塑的机制，但可以推测：内皮细胞功能的减弱，可能是导致移植静脉管壁增厚的原因之一。ERK1/2信号通路与EphB4信号通路有密切关联[22-23]，且同时满足以下条件：(1)同EphB4一样在静脉源细胞中表达；(2)在VGA过程中，其蛋白表达的改变与移植静脉内膜增生过程密切相关[24]；(3)ERK1/2与Eph家族有交互作用[25]。通过ERK通路阻断实验，进一步证实了ERK1/2在EphB4主导的调控过程中所起的作用。
通过实验验证了静脉特异性内膜增生的机制之后，下一步的工作将集中对动脉特异性的内膜增生进行研究，从一个新的角度来探索动、静脉内膜增生的分子本质差异。移植静脉适应动脉血流的过程中，保证静脉指纹分子EphB4的表达，可能保持了移植静脉的静脉属性，减轻血管重塑，改善移植静脉狭窄；EphB4-ERK1/2在静脉特异性的调控机制中的可能通过控制EphB4的表达而起主要作用。
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