胰腺癌是我国癌症相关死亡的第5位主要原因[1]。2015年，我国胰腺癌新发病例90.1万例，死亡病例79.4万例[1]。胰腺癌也是恶性肿瘤中预后最差的肿瘤类型，患者平均存活时间为6个月，5年生存率仅6%[2]。即便患者在早期可成功诊断，但术后复发率仍很高, 复发与转移仍是影响胰腺癌预后的主要原因[3]。因此，对胰腺癌发生、发展及发病机制作深入探索将为胰腺癌的诊治提供新的思路。长链非编码RNA（Long non-coding RNA，LncRNA）是一类长度超过200 bp的非编码RNA，近几年已成为肿瘤分子生物学研究热点[4]。LncRNA参与多种生物学过程，如细胞分化、衰老、凋亡和转移、化疗耐药性等[5-6]。研究[7-9]发现，LncRNA能通过表观遗传修饰、剪接、RNA降解、翻译后修饰等方式沉默抑癌基因或激活促癌基因，参与肿瘤发生和转移等过程。先前报道，LncRNA BCAR4参与多种肿瘤发生发展过程，如乳腺癌[10]、骨肉瘤[11]、肺癌[12]等。但至今尚无LncRNA BCAR4在胰腺癌中的相关报道。本研究旨研究LncRNA BCAR4对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响，并探讨其机制。
1 材料与方法
1.1 材料
人正常胰腺导管上皮细胞系HPDE6-C7及胰腺癌细胞系AsPC-1、HPAC、BxPC-3、Panc-1均购自美国ATCC细胞库，实验所需的磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（phosphorylated mammalian target of rapamycin，p-mTOR）、磷酸化核糖体蛋白S6激酶（phosphorylated ribosomal protein S6 kinase，p-P70S6K）、核糖体蛋白S6激酶（ribosomal protein S6 kinase，P70S6K）及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）一抗均购自美国Santa Cruze公司，二抗购自美国BD公司，RPMI 1640培养基购自上海经科化学科技有限公司，LncRNA BCAR4 siRNA套装购自广州锐博生物科技有限公司，LipofectamineTM 2000转染试剂购自美国BD公司。RT-PCR仪购自美国BD公司，HBS-1096B酶标仪购自南京德铁实验设备有限公司，蛋白免疫印迹电泳设备购自美国Bio-Rad公司。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养 人正常胰腺导管上皮细胞系HPDE6-C7及胰腺癌细胞系AsPC-1、HPAC、BxPC-3、Panc-1均种植于RPMI 1640培养基, 并培养于37 ℃、5% CO2培养箱中，于48 h后消化传代，实验所用的细胞均为对数生长期细胞。
1.2.2 细胞转染及分组 取AsPC-1细胞系分成3组，si-BCAR4组、阴性对照组及空白对照组，并制备终浓度为80 nmol/L的LncRNA BCAR4siRNA脂质体复合物，将AsPC-1细胞系以每孔2×105个接种于6孔板上，待细胞生长至70%～80%时，更换无血清培养基，si-BCAR4组和阴性对照组经LipofectamineTM 2000分别转染BCAR4 siRNA序列和阴性对照siRNA序列，以无转染的AsPC-1细胞为空白对照。BCAR4 siRNA序列正义链：5'-GGG ACU UGA GUU AUG UUG GUG GCU A-3'；反义链：5'-UAG CCA CCA ACA UAA CUC AAG UCC C-3'。阴性对照siRNA序列正义链：5'-UUC UCC GAA CGU GUC ACG U-3'；反义链：5'-ACG UGA CAC GUU CGG AGA A-3'。
1.2.3 qRT-PCR检测 RNA的提取：收集si-BCAR4组、阴性对照组及空白对照组3组细胞，每孔不少于1×106个细胞，用All-in-One miRNA抽提试剂盒提取总RNA，取5 μg总RNA行反转录合成cDNA，以cDNA为模板，GAPDH为内参，LncRNA BCAR4引物序列正向：5'-ACA GCA GCT TGT TGC TCA TCT-3'， 反 向：5'-TTG CCT TGG GGA CAG TTC AC-3'；GAPDH引物序列正向：5'-GCT CTC TGC TCC TCC TGT TC-3'； 反向：5'-ACG ACC AAA TCC GTT GAC TC-3'。 行qRT-PCR反应。反应条件：95 ℃预变性30 s，95℃5s，60 ℃ 20 s，共40个循环，使用Bio-Rad real-time PCR仪自带软件分析样本的循环阈值（cycle threshold，CT），采用 2−ΔΔCt方法定量，计算LncRNA BCAR4的相对表达量。
1.2.4 细胞增殖能力测定 CCK-8法测定si-BCAR4组、阴性对照组及空白对照组3组细胞增殖能力，将si-BCAR4组、阴性对照组及空白对照组3组细胞消化成单细胞悬液后，以2×103个/孔将3组细胞种植于96孔板上，每个孔按200 µL的体积上样，经0、1、2、3、4 d培养后，20 µL CCK-8溶液加入于每孔中去，继续培养1 h后，在450 nm波长下，用酶标仪测定各孔吸光值，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞增殖曲线。
1.2.5 细胞凋亡测定 采用流式细胞术测定si-BCAR4组和阴性对照组两组细胞凋亡率，染色采用Annexin V/PI，将si-BCAR4组和阴性对照组两组细胞消化后，结合缓冲液重悬混匀后，加入Annexin V抗体，避光染色10 min后加入适量PBS溶液及PI染料，流式细胞仪检测Annexin V阳性细胞比例来确定细胞凋亡率。
1.2.6 Western blot检测 采用Western blot法，将si-BCAR4组和阴性对照组两组细胞裂解、变性后，上样量为每孔30 μg蛋白，浓缩胶条件为50 min 80 V，分离胶条件为100 min 100 V，常规 转 膜，加入p-mTOR、mTOR、p-P70S6K及P70S6K一抗，一抗浓度为1:200，于4 ℃孵育过夜，二抗（1:1 000）经37 ℃孵育4 h后，PBST漂洗3次，在ECL发光液下显影，Quantity One 1-D分析目标蛋白灰度值，目标蛋白相对表达量=目标蛋白灰度值/GAPDH灰度值，实验重复3次，取平均值。
1.3 统计学处理
采用SPSS 20.0统计软件行数据分析，计量资料以均数±标准差（
±s）表示，两组间的比较采用t检验，3组比较先用方差分析，有意义时，两两比较再用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 LncRNA BCAR4在胰腺癌细胞系中的表达
qRT-PCR结果显示，人正常胰腺导管上皮细胞系HPDE6-C7的LncRNA BCAR4的相对表达量为1.0±0.03，胰腺癌细胞系AsPC-1、HPAC、BxPC-3、Panc-1中LncRNA BCAR4的相对表达量分别为5.38±0.27（P＜0.001）、4.05±0.22（P＜0.01）、3.49±0.15（P＜0.05）及2.94±0.11（P＜0.05），LncRNA BCAR4在胰腺癌细胞系中呈高表达（图1）。
图1 LncRNA BCAR4在不同胰腺癌细胞系及正常胰腺导管上皮细胞系中的表达
Figure 1 The expression of LncRNA BCAR4 in different pancreatic carcinoma cell lines and normal pancreatic duct epithelial cells
2.2 抑制LncRNA BCAR4表达对AsPC-1细胞增殖的影响
qRT-PCR结果显示，转染48 h后，si-BCAR4组LncRNA BCAR4相对表达量为0.26±0.03，阴性对照组为1.03±0.05，空白对照组为1.0±0.03，si-BCAR4组LncRNA BCAR4相对表达量低于阴性对照组和空白对照组（均P＜0.001）（图2A）；CCK-8实验结果显示，转染0、24、48、72、96 h后，si-BCAR4组与阴性对照组的OD450nm值分别为[（0.33±0.04） vs.( 0.32±0.04)，P＞0.05]、[（0.49±0.05） vs.( 0.52±0.06)，P＞0.05]，[（0.72±0.07）vs.( 0.84±0.08)，P＞0.05]，[（0.97±0.09）vs (1.28±0.10)，P＜0.05]、[（1.31±0.10）vs.( 1.97±0.14)，P＜0.01]，空白对照组与阴性对照组各时间点OD450nm值差异均无统计学意义（均P＞0.05）（图2B）。
图2 BCAR4 siRNA转染对AsPC-1细胞LncRNA BCAR4表达及增殖的影响 A：LncRNA BCAR4表达检测；B：细胞增殖检测
Figure 2 Effect of BCAR4 siRNA transfection on LncRNA BCAR4 expression and proliferation in AsPC-1 cells A: Determination of LncRNA BCAR4 expression; B: Determination of cell proliferation
2.3 抑制LncRNA BCAR4表达对AsPC-1细胞凋亡的影响
流式细胞检测结果显示，转染4 8 h后，si-BCAR4组细胞凋亡率为（15.63±3.19）%，阴性对照组为（4.84±1.67）%，si-BCAR4组细胞凋亡率高于阴性对照组（P＜0.01）（图3）。
图3 细胞凋亡检测
Figure 3 Apoptosis analysis
2.4 抑制LncRNA BCAR4表达对AsPC-1细胞mTOR信号通路的影响
Western blot结果显示，si-BCAR4组p-mTOR蛋白相对表达量为0.37±0.04，阴性对照组为1.0±0.05，si-BCAR4组p-mTOR蛋白相对表达量低于阴性对照组（P＜0.01）；si-BCAR4组p-P70S6K蛋白相对表达量为0.43±0.04，阴性对照组为1.0±0.08，si-BCAR4组p-P70S6K蛋白相对表达量低于阴性对照组（P＜0.01）；两组mTOR与P70S6K相对表达量均无统计学差异（均P＞0.05）（图4）。
图4 Western blot检测mTOR信号通路相关蛋白
Figure 4 Western blot analysis for mTOR signaling pathway related proteins
3 讨 论
近年来，胰腺癌发病率呈逐渐上升趋势，已成为我国常见的恶性肿瘤之一[1]。胰腺导管腺癌是胰腺癌的主要病理类型，它由腺泡导管化生或肿瘤前体病变发展而来[13-14]。在过去30年里，其他胃肠道恶性肿瘤患者的生存率呈持续上升趋势，但胰腺癌患者的预后并无显著改善，超过80%的患者在手术切除后会复发[15-17]。
当前研究[18-20]表明，胰腺癌的发生发展受基因变异及表观遗传学的影响。越来越多的证据表明，LncRNA常在肿瘤发展、转移阶段呈异常表达。Godinho等[10]指出LncRNA BCAR4在27%的原发性乳腺癌患者肿瘤中表达，LncRNA BCAR4高表达与患者无进展生存率相关。Chen等[11]发现LncRNA BCAR4高表达于骨肉瘤组织，过表达的LncRNA BCAR4与肿瘤大小、分期、肺转移及预后不良相关，LncRNA BCAR4敲除后可通过调控锌指蛋白2的表达抑制骨肉瘤增殖和迁移。Bae等[21]检测了LncRNA BCAR4在原发性肺癌组织和癌旁组织中的表达差异，发现LncRNA BCAR4在71%的肺癌细胞中高表达，过表达LncRNA BCAR4后肺癌细胞生长能力增强，而采用siRNA技术敲除肿瘤细胞LncRNA BCAR4表达后，细胞克隆形成能力明显受抑制。本研究通过荧光定量PCR检测了LncRNA BCAR4在胰腺癌细胞系和正常胰腺细胞中的表达差异，证实LncRNA BCAR4在胰腺癌细胞中高表达。随后，采用siRNA技术行功能研究，CCK-8检测表明LncRNA BCAR4敲除后胰腺癌细胞增殖能力明显受抑制，流式细胞术检测发现该基因沉默后肿瘤细胞凋亡率升高。这些结果表明，LncRNA BCAR4是作为促癌基因参与胰腺癌致瘤过程，可影响肿瘤细胞增殖和凋亡过程。
有报道[22]指出，LncRNA BCAR4通过激活mTOR信号途径促进软骨细胞增殖和迁移。因此，我们通过Western blot技术发现胰腺癌细胞敲除LncRNA BCAR4后p-mTOR和p-P70S6K蛋白表达降低，mTOR和P70S6K蛋白表达上升。mTOR是一种典型的丝氨酸/苏氨酸激酶，在调节细胞增殖、生长、分化、迁移和生存中起核心作用[23]。它通过磷酸化激活下游效应物4EBP1和P70S6K激酶参与细胞生长、周期进展（如诱导G1期基因细胞周期蛋白D的表达）和细胞代谢等。mTOR-p70S6K信号通路常在多数人类肿瘤细胞系中被激活，如胰腺癌和小细胞肺癌等[24]。研究[25]发现，细胞质磷酸化mTOR（p-mTOR）的表达与胃癌肿瘤侵袭深度呈正相关，高表达细胞质p-mTOR的患者无复发生存率和总生存率较低。在本研究，本研究发现敲除LncRNA BCAR4的胰腺癌细胞中活性mTOR（p-mTOR）及活性p70S6K（p-P70S6K）蛋白表达水平降低，表明mTOR-p70S6K信号途径因LncRNA BCAR4敲除而受抑制。推测，LncRNA BCAR4沉默抑制胰腺癌细胞增殖和促进凋亡，与mTOR-p70S6K信号通路失调有一定关联。
综上，LncRNA BCAR4在胰腺癌细胞系中高表达，沉默其表达可抑制胰腺癌细胞增殖、促进凋亡，其机制可能与mTOR-p70S6K信号通路失调有关，这为胰腺癌发生发展的分子机制研究提供了新的思路，也为肿瘤诊断、治疗、预后提供新的策略。
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