暂时性和永久性甲状旁腺功能低下是甲状腺外科的常见并发症，有文献[1-2]报道其发生率分别为14%～60%和4%～11%。因此,术中甲状旁腺的识别与保护尤其重要，除了细致的解剖保护甲状旁腺及其血供，甲状旁腺自体移植已越来越多地采用以保留甲状旁腺功能[3]。在手术中及自体移植之前必须判定甲状旁腺组织，以免发生误切、错误移植和错误保留转移癌组织。笔者自2016年1月采用术中无染色明视野镜检法判定甲状旁腺组织，与传统术中冷冻病理检测比较，旨在评定无染色明视野镜检法判定甲状旁腺组织准确性和临床应用价值。
1 资料与方法
1.1 一般资料
2016年1月—2017年6月期间，笔者所在医疗组连续收治并行手术治疗的357例甲状腺乳头状癌患者，排除术中已经明确甲状旁腺患者，将术中需要判定的疑似下甲状旁腺组织的115例甲状腺癌患者纳入研究对象。其中男28例，女87例；年龄14～68岁，平均年龄（46.3±8.6）岁；TNM分期I期69例，II期17例，III期23例，IV期6例；行甲状腺全切38例，甲状腺全切+单侧中央区淋巴结清扫51例，甲状腺全切+双侧中央区淋巴结清扫20例，甲状腺全切+双侧中央区淋巴结清扫+侧颈区淋巴结清扫6例。
1.2 方法
手术由同一组医生施行，术中获取肉眼判断115例的疑似下甲状旁腺组织196枚，对术中找到疑似甲状旁腺组织后，由第一助手取疑似甲状旁腺组织的一小部分约2 mm3，均等分成2份，1份用生理盐水冲洗，放在载玻片上，以盖玻片压碎组织[4]。立即送病理科行400倍镜明视野镜检。记录从制作玻璃压片到出病理报告所耗时间。对另1份送术中冷冻病理，记录送检到出病理报告所耗时间。与无染色明视野镜检判定结果进行比较。
每例患者术前第1天、术后1、3 0 d均测定血清全段甲状旁腺激素（intact parathyroid hormone，iPTH）和血清钙水平,评价术前术后的甲状旁腺功能变化。iPTH采用化学发光法测定（贝克曼DX1800生化仪），正常参考值范围为（12～88）pg/mL。血清钙采用偶氮砷III法（雅培C16000全自动分析仪），正常参考值范围为（2.11～2.52）mmol/L。
1.3 统计学处理
采用SPSS 24.0统计软件进行数据分析，无染色明视野镜检法与术中冷冻病理检查方法的一致性检验采用κ检验，即κ值（0＜κ≤1）越大，一致性越强，＜0.2，一致性非常弱；0.4≤κ＜0.6，一致性一般：0.6≤κ＜0.8，一致性好；κ＞0.8，一致性非常强，κ=1完全一致。无染色明视野镜检法与术中冷冻病理检查判定结果是否有统计学差异采用配对χ2检验（McNemar检验）；术前术后甲状旁系腺功能的变化采用配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 术中无染色明视野镜检结果和术中冷冻结果
无染色明视野镜检法400倍显微镜下各种组织特点：甲状旁腺组织特点是可见特征性的褐色小细胞密集团广泛分布，透明脂肪细胞散在其中（图1A）;脂肪组织特点是脂肪细胞密集成团，相互重叠（图1B）；淋巴结的特点是脂肪聚集成团，白色小细胞密集团片状分布，白色小细胞团体积较甲状旁腺中褐色小细胞密集团大（图1C）；胸腺组织特点是与脂肪组织相似，除了脂肪细胞密集成团相互重叠外，还有少量白色小细胞散在其中（图1D）。
196枚疑似甲状旁腺组织无染色明视野镜检法判定结果见表1。其中无染色明视野镜检法判定甲状旁腺组织为142枚，术中冷冻病理证实均为甲状旁腺；无染色明视野镜检法判定的29枚脂肪组织中，术中冷冻病理判定为脂肪有25枚，甲状旁腺1枚，胸腺1枚，淋巴结2枚；无染色明视野镜检法判定的17枚淋巴组织中，术中冷冻病理判定淋巴结有14枚，甲状旁腺2枚，胸腺1枚；无染色明视野镜检法判定的胸腺组织8枚中，术中冷冻病理判定胸腺有5枚，甲状旁腺1枚，脂肪2枚。因此，术中冷冻病理共检测出甲状旁腺146枚，脂肪27枚，淋巴结16枚，胸腺7枚（表1）。甲状旁腺组织均顺利压片平均耗时为4～6 min，送术中冷冻耗时约30～40 min，每例手术中平均送检1.7枚疑似甲状旁腺组织。
图1 疑似下甲状腺旁腺组织无染色明视野镜检图（×400） A：甲状旁腺组织；B：脂肪组织；C：淋巴结组织；D：胸腺组织
Figure 1 Images of bright-field microscopy without staining for suspected inferior parathyroid tissue (×400) A: Parathyroid tissue;B: Adipose tissue; C: Lymph node tissue; D: Thymus tissue
表1 196枚可疑下甲状旁腺组织两种检测方法的检测结果
Table 1 The detection results of the 196 suspected parathyroid tissues by the two methods
组织 无染色明视野快速镜检 冷冻病理切片甲状旁腺 142 146脂肪 29 27淋巴结 17 16胸腺 8 7
2.2 术中无染色明视野镜检与术中冷冻病理结果比较
无染色明视野镜检判定各类组织的敏感性和特异性均较高，判定甲状旁腺的敏感性为97.26%、特异性为100.00%，脂肪的敏感性为93.00%、特异性为97.63%，淋巴结的敏感性为88.00%、特异性为98.33%，胸腺的敏感性为83.00%、特异性为98.42%。两种判定方法κ值均较高，即无染色明视野镜检法判定甲状旁腺与术中冷冻病理判定甲状旁腺具有非常强的一致性。无染色明视野镜检法与术中冷冻病理检查判定各种类型组织的判定结果配对χ2检验，两种方法的判定结果无统计学差异（均P＞0.05）（表2）。
表2 无染色明视野镜检法与术中冷冻病理检测方法的比较分析结果
Table 2 Comparative analysis of bright-field microscopy without staining and intraoperative frozen pathological detection
组织 敏感性（%） 特异性（%） κ P甲状旁腺 97.26 100.00 0.948 0.125脂肪 93.00 97.63 0.875 0.688淋巴结 88.00 98.33 0.835 1.000胸腺 83.00 98.42 0.704 0.625
2.3 术中术后甲状旁腺功能比较
115例甲状腺乳头状癌患者术前与术后1、30 d的iPTH及血清钙平均值见表3。术后1、30 d的iPTH与血清钙分别与术前的iPTH及血清钙进行配对t检验。术后1 d与术前iPTH相比，iPTH下降有统计学差异（P＜0.05），血清钙下降无统计学差异（P＞0.05）；术前与术后30 d iPTH及血清钙变化均无统计差异（均P＞0.05）。
表3 术前术后甲状旁腺功能变化比较分析
Table 3 Comparison of parathyroid function parameters before and after operation
时间 iPTH（pg/mL） P 血清钙（mmol/L） P术前1 d 41.96±10.22 — 2.25±0.10 —术后1 d 29.23±9.14 ＜0.05 2.18±0.07 ＞0.05术后30 d 40.25±9.42 ＞0.05 2.21±0.09 ＞0.05
3 讨 论
甲状腺癌手术中，原则上首先是尽最大可能清除病灶，其次是尽可能原位保留甲状旁腺[5]。原位保留甲状旁腺，避免和减少术后甲状旁腺功能低下的发生的前提是术中准确的辨认甲状旁腺[6]。精细的被膜解剖有利于甲状旁腺辨识和原位保护，有效地辨认甲状旁腺和保护其血供是预防甲状旁腺功能低下最有效手段[7-10]。精细解剖甲状旁腺后，多数因血供在一定程度受损或者其供血血管受刺激后痉挛收缩而使其变为棕黄至棕黑色，而脂肪组织和淋巴结一般不会变色，这时肉眼就可以辨认出甲状旁腺进行原位保护[11]。上甲状旁腺因解剖位置恒定，术中肉眼易辨识，但对于下甲状旁腺因位置不固定，常常需与淋巴结、脂肪组织、胸腺组织相互鉴别，仅仅靠肉眼依据颜色和形状来辨识存在困难。因此，下甲状旁腺误切几率高。特别是甲状腺癌手术中，为了保证淋巴结清扫的彻底性，甲状旁腺误切几率大大增加，从而导致一过性甲状旁腺功能减退，甚至的永久性甲状旁腺功能减退发生率增加。术后甲状旁腺功能减退的患者会出现面唇部或手足皮肤针刺样感觉、麻木强直感、手足抽搐、呼吸困难、全身抽搐甚至昏迷等不同程度的低血清钙症状，需要长期服用药物改善症状，严重影响患者生活质量。甲状旁腺误切的补救办法是优先选择甲状旁腺自体移植，甲状旁腺自体移植能有效减少术后永久性甲状旁腺功能减退的发生[12-13]，但前提是移植物必须确认是误切的甲状旁腺组织。若将癌转移的淋巴结误判为甲状旁腺组织行自体移植，最终导致肿瘤种植扩散的严重后果。因此，提高术中甲状旁腺的辨识率，避免或减少术后甲状旁腺功能减退是甲状腺外科医师面临的重要课题。
目前术中除肉眼辨认外，术中判定甲状旁腺的常用的方法包括静脉注射亚甲蓝甲状旁腺正显影、纳米炭甲状旁腺负显影、术中光学相干层析成像系统识别技术、术中冷冻快速病理检查等。早在1971年，Dudley等[14]报道术前静脉注射亚甲蓝用于甲状旁腺正显影判定甲状旁腺。后来认识到病理性甲状旁腺组织易被亚甲蓝染色[1, 15]，而正常甲状旁腺组织染色率很低，褪色较快[1, 16]，亚甲蓝还能使淋巴结染色[17]。亚甲蓝虽然价格较为便宜，但其甲状旁腺正显影的敏感性较低，而且有神经系统的毒副反应[15]，目前甲状腺癌手术中不推荐其用于正常甲状旁腺的辨认[1]。与其他示踪剂相比，纳米炭具有黑染率高、示踪速度快、持续时间长、淋巴趋向性强的特点。因此在术中纳米炭对甲状腺及区域淋巴结均有高度识别示踪作用[18]，可提高术中淋巴结及转移淋巴结清扫数目[19-20]，更重要的是它能负显影甲状旁腺，利于甲状旁腺的原位保护，降低术中甲状旁腺损伤几率和误切率[21]。因此它是目前甲状腺癌手术辨识甲状旁腺较为理想的示踪剂。但是术中注射纳米炭需要掌握有一定的技巧，学习曲线较长，若注射不当，导致无法辨认甲状旁腺；纳米炭虽然没有毒性的报道，但是在人体内长期残留，同时纳米炭碳价格偏贵，不在医保报销范围内，临床应用大大受限。有学者[22-23]报道术中光学相干层析成像系统（OCT）可以不固定，染色，或组织切除用以术中判定颈部甲状腺，脂肪，肌肉，淋巴结，甲状旁腺组织准确率达98.42%，但费用昂贵。这些判定方法，因术者的经验、患者的个体差异及经济效益的不同存在一定局限性，术中冷冻病理切片是误切的甲状旁腺自体移植前的确认甲状旁腺组织最常用的方法，它是术中确认甲状旁腺的金标准。本研究中就是以术中冷冻病理片为对照，探讨无染色明视野镜检法辨认甲状旁腺的敏感性和特异性，是否具有替代术中冷冻病理确认甲状旁腺的潜力。
活体组织压片后无染色明视野镜检法在甲状腺癌术中辨认甲状旁腺国内由1994年李泮泉等[24]报道。它的操作方法是：术中取可疑甲状旁腺组织的1 mm3大小，用生理盐水冲洗，放在载玻片上，以盖玻片压碎组织。立即行100倍显微镜下明视野镜检。该方法镜检甲状旁腺组织的特点是：镜下可见许多褐色小细胞密集团,可见体积较大透明脂肪细胞散在分布其中，部分脂肪细胞重叠。镜下较容易与脂肪、淋巴结及胸腺组织区分开来。
本研究中采用无染色明视野镜检法采用400倍视野显微镜镜下辨认甲状旁腺组织，鉴别要点主要是依据脂肪细胞的含量和小细胞的含量、密度、颜色、大小、分布特点不同来鉴定。需要区分的四种组织的共同特点是均含有脂肪细胞。脂肪组织和胸腺组织含有脂肪细胞最多，基本都是由脂肪细胞组成，脂肪组织和胸腺组织主要区别在于胸腺中脂肪细胞相对小些，而且小细胞集团散在其中；淋巴组织含脂肪细胞次于脂肪和胸腺，脂肪细胞片状分布其中；甲状旁腺组织最少，脂肪细胞散在分布其中。甲状旁腺组织可见特征性褐色小细胞密集团，而淋巴结的小细胞密集团较甲状旁腺大，而且颜色是白色，很容易与淋巴组织鉴别。本研究显示无染色明视野镜检法具有很高的敏感性（97.26%）和特异性（100%）。同样该法辨认脂肪，淋巴结及胸腺组织均有很高的敏感性和特异性。
本研究中以术中冷冻病理检测为金标准，采用κ检验测定无染色明视野镜检法与术中冷冻病理检测这两种方法判定各类组织的一致性，两种方法判定甲状旁腺、脂肪、淋巴结的各自一致性κ检验κ均大于0.8，一致性非常强，仅判定胸腺的κ值在0.6到0.8之间，一致性仍好。因此，两种判定方法一致性非常强。表明无染色明视野镜检法的准确性很接近术中冷冻病理检测，在很大程度可以替代术中冷冻病理用于判定甲状旁腺。另外，本研究中采用配对χ2检验测定两种方法判定各类组织的判定结果无统计学差异（P＞0.05），侧面进一步说明术中无染色明视野镜检法能较为准确的鉴别甲状旁腺、脂肪、淋巴结、胸腺组织，判定甲状旁腺的可靠性接近术中冷冻病理检测结果。比较术前术后术后iPTH及血清钙水平发现，术后1 d与术前iPTH相比，iPTH下降有统计学差异（P＜0.05），而血清钙下降无统计学差异（P＞0.05）；术前与术后30 d iPTH及血清钙变化均无统计差异（P＞0.05）。表明术后有一过性甲状旁腺功能减退，术后1个月左右甲状旁腺功能基本恢复到术前水平。通过对比术前术后甲状腺功能的变化，进一步说明本研究中无染色明视野镜检法在甲状腺癌手术中判定甲状旁腺可靠性高，利于甲状旁腺的保护和功能的保留。
无染色明视野镜检法无需术中注射显影剂，无毒副反应，仅需要切取＜1 mm3疑似组织，切取的组织块体积越小细胞越不容易重叠，也就越容易鉴别。而文献[25-26]报道甲状旁腺长5～7 mm，宽3～4 mm，厚2 mm，所以切取＜1 mm3对于原位保护或者自体移植后甲状旁腺功能影响不大，因此认为该方法安全性较好。相对术中冷冻病理检测,它少了冷冻切片、快速染色以及固定等操作步骤，操作过程简便，耗时短，平均耗费时间约为4～5 min，比术中冷冻病理学检查耗时缩短近25 min。缩短手术时间，相应也降低了手术麻醉费用。按照60 kg体质量全麻麻醉维持费800～1 000元/h的标准计算，缩短25 min可降低约450元左右的麻醉费用。对于误切的甲状旁腺组织，避免了较长时间的体外暴露，增加移植的成活率，降低甲状旁腺功能低下的发生率。另外，无染色明视野镜检法病理检测费用也比术中冷冻病理低，因此，其时间经济效益优势明显，符合卫生经济学原则，值得临床应用推广。
综上所述，甲状腺癌手术中，无染色明视野镜检法辨认甲状旁腺的具有很高的敏感性和特异性，术中能准确分辨出甲状旁腺组织、脂肪组织、淋巴结组织、 胸腺组织。准确性接近术中冷冻病理，从而减少甲状旁腺误切和错误自体移植；同时具有操作简便、耗时短，费用低廉等优点，很大程度上可替代术中冷冻病理判定甲状旁腺，值得临床应用推广。
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