原发性肝癌（primary hepatocellular carcinoma，PHC）是指由肝细胞或肝内胆管上皮细胞发生的恶性肿瘤，其中肝细胞癌占85%以上，是我国第四位常见的恶性肿瘤，病死率位居第三[1]。肝细胞癌恶性程度高，易发生转移，许多患者确诊时已发展为晚期，5年生存率小于5%[2]。驱动蛋白超家族（kinesin superfamily proteins，KIFs）是一类分子马达，通过水解ATP产生能量来进行细胞内囊泡、细胞器、RNA等物质的运输[3-4]。驱动蛋白家族成员15（kinesin family member 15，KIF15）是该家族中的一员，属于kinesin-12亚家族，又称hklp2，是除Kinesin-5之外第二个四聚体纺锤体马达[5-6]。已有研究[7-9]表明，KIF与乳腺癌、肺癌、胰腺癌的发生发展过程相关，然而其在肝癌中的研究尚未报道。本研究通过生物信息学分析KIF15与肝细胞癌的关系，并通过下调其表达探究其对肝细胞癌转移侵袭能力的影响。
1 材料与方法
1.1 细胞株与主要试剂
人肝癌细胞系SMMC-7721由华中科技大学附属同济医院胆胰外科实验室馈赠。DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司，siKIF15购自广州锐博生物科技有限公司，Lipofectamine2000购自美国赛默飞公司，Transwell小室及六孔板购自美国Corning公司，KIF15、GAPDH抗体购自美国CST公司，CCK-8试剂购自日本Dojindo公司，Matrigel基质胶购于美国BD公司。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养 人肝癌细胞系SMMC-7721在含10%胎牛血清的DMEM培养基、37 ℃、5%CO2的条件下，于细胞培养箱中培养，根据细胞生长情况每2～3天更换新鲜培养基或进行细胞传代培养。
1.2.2 生物信息学分析 从UCSC Xena网站下载TCGA Liver Cancer肝癌数据中KIF15的表达情况及相关临床资料[10]。基因表达使用标准化高敏荧光序列进行分析，将标准化计数结果作为基因表达程度的估计值。分析得到不同TNM分期肝癌患者体内KIF15的表达以及肝癌患者的生存曲线。
1.2.3 siRNA转染 选取处于对数生长期的SMMC-7721细胞制备细胞悬液，取2×105个细胞接种于六孔板中，待细胞贴壁后按照lipofectamine 2000试剂说明书将siKIF15及siControl分别转染入细胞中作为实验组及对照组。Western blot检测实验组及对照组细胞中KIF15表达量。
1.2.4 CCK-8法检测细胞增殖活性 分别取转染了siKIF15的实验组及转染了siControl的对照组SMMC-7721细胞，调整细胞密度为2×104个/mL接种于96孔培养板中，每孔100 μL，置于培养箱中培养。待细胞完全贴壁后吸去培养液，于贴壁0、24、48、72 h后每孔加入20 μL CCK-8，继续培养4 h，于酶标仪波长450 nm处读取吸光度（OD）值。
1.2.5 流式细胞术检测细胞周期 分别收集实验组及对照组细胞，PBS洗涤后缓慢滴入预冷的无水乙醇，调整乙醇浓度至75%，充分振荡，-20 ℃固定过夜。800 r/min，5 min收集细胞，PBS洗涤后加入 50 μL RNase及 50 μL碘化丙啶（PI），室温避光孵育30 min。流式细胞仪检测细胞周期分布，采用CellQuest及ModFit软件分析实验结果。
1.2.6 Trasnwell侵袭实验 Matrigel基质胶用无血清培养基按1:8稀释，加入小室上室面，4 ℃过夜。第2天于37 ℃ 30 min水化基底膜，同时制备转染48 h后的SMMC-7721细胞悬液（用不含血清的培养基重悬），密度为2×105个/mL，每个小室中加入200 μL，下室加入含10%血清的培养基600 μL，置于培养箱中培养24～36 h后用PBS洗两遍，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫染色30 min，用棉签擦去上室面细胞，晾干并拍照。
1.3 统计学处理
采用SPSS 23.0对实验数据进行分析、整理。计量资料采用均数±标准差（
±s）表示，两组比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 KIF15在不同临床资料分组的肝癌患者中的相对表达情况
通过分析得出，T2～T4分期的肝癌患者中K I F 15相对表达量明显高于T1分期的患者[（-1.337±2.249） vs. （-1.863±1.924）；t=2.562，P＜0.05]；TNM分期在II～IV期的患者KIF15相对表达量明显高于TNM分期为I期的患者[（-1.282±2.229） vs. ( -1.839±1.921）；t=2.639，P＜0.01]（图1）。KIF15表达量在淋巴结转移阳性组和淋巴结转移阴性无统计学差异（P＞0.05）。
图1 KIF15在不同临床资料分组的肝癌患者中的表达比较
Figure1 Comparison of KIF15 expressions between patients grouped by different clinical data
2.2 KIF15表达量对肝癌患者生存率的影响
通过绘制生存曲线并进行统计学分析得出，KIF15相对表达量≥-1.45的肝癌患者生存率明显低于KIF15相对表达量＜-1.45的患者，差异具有统计学意义（P＜0.05）（图2）。
2.3 Western blot检测KIF15沉默效率
将构建好的siKIF15转染入SMMC-7721细胞系中，Western blot检测转染效率，结果表明，转染了siKIF15的细胞KIF15蛋白表达量明显低于转染siControl的对照组（图3）。
2.4 沉默KIF15抑制了SMMC-7721的增殖
CCK-8结果表明，转染了siKIF15的实验组SMMC-7721细胞增殖活性较对照组细胞有所降低。其中，实验组细胞在96 h的吸光度为1.826±0.079，对照组为2.374±0.156，差异有统计学意义（t=3.124，P＜0.05）（图4）。
图2 不同KIF15表达量肝癌患者的生存曲线
Figure2 Survival curves of liver cancer patients with different KIF15 expressions
图3 Western blot检测沉默效率
Figure3 Silencing efficiency detection by Western blot
图4 细胞增殖曲线
Figure4 Cell proliferation curves
2.5 沉默KIF15使SMMC-7721阻滞在G0/G1期
流式细胞术结果表明，转染了siKIF 15的实验组SMMC-7721细胞G1期比例高于对照组，差异具有统计学意义[（81.04±2.47）% vs.（64.98%±2.67）%，t=4.417，P＜0.05]；S期比例低于对照组，差异具有统计学意义[（13.35±2.16）% vs.（28.48±2.14）%，t=4.978，P＜0.01]；G2期比例无统计学差异（P＞0.05）（图5）。
图5 细胞周期分析
Figure5 cell cycle analysis
2.6 沉默KIF15降低了SMMC-7721的侵袭能力
Transwell实验结果表明，转染了siKIF15的SMMC-7721细胞侵袭数目为（417±164）个，明显低于对照组细胞侵袭数目（951±159）个，差异有统计学意义（t=4.679，P＜0.01）（图6）。
图6 细胞侵袭力检测
Figure6 Determination of invasion ability of the cells
3 讨 论
近年来大量研究[11-13]表明，KIFs是一类保守的微管依赖的分子运动蛋白，具有ATP酶活性和运动特征，其与神经退行性疾病、代谢性疾病、肾病等多种疾病均有关联。除此之外，KIFs在肿瘤的发生发展过程中也起到重要作用[14-17]。学者[18-20]认为，在肿瘤细胞进行分裂的过程中，异常表达的KIFs将通过影响染色体的凝集、纺锤体的形成发生异常，进而影响肿瘤细胞增殖和侵袭转移能力。例如在神经胶质瘤中，KIF1B通过诱导膜型基质金属蛋白酶促进胶质瘤细胞的迁移和侵袭[21]。在沉默KIF2A后，乳腺癌细胞的增殖和迁移能力被明显抑制，并且其与乳腺癌的预后密切相关[22]。而在肺癌细胞中，下调KIF23促进凋亡的发生，其被认为是肺癌患者潜在治疗靶点[23]。肝细胞癌是一类恶性程度极高的肿瘤，KIFs对肝癌发生发展的作用尚不明确[24]。本研究着重分析TCGA数据库中KIF15的表达与临床资料的相关性，探究KIF15对肝癌恶性生物学行为的影响。
本研究首先通过TCGA Liver Cancer肝癌数据分析得出KIF15在TNM II～IV期患者的表达量明显高于TNM I期患者，其中T分期为2～4期的患者KIF15表达量明显高于T1期患者。而进一步通过绘制生存曲线并统计分析得出KIF15高表达的肝癌患者生存率明显低于KIF15低表达患者，提示KIF15可以作为判断肝癌预后的指标，即KIF15高表达患者临床预后较差。在细胞实验中，将siKIF15导入肝癌细胞并通过Western blot验证了其沉默效率。CCK-8实验表明沉默KIF15后肝癌细胞增殖能力明显降低，进一步分析细胞周期发现沉默KIF15能够将肝癌细胞周期阻滞在G0/G1期，表明KIF15可以通过促进肝癌细胞的G1/S期转化而加速其增殖。接下来本研究还探讨了KIF15与肝癌细胞侵袭能力的关系，Transwell实验表明，相比于对照组，沉默KIF15肝癌细胞侵袭能力明显下降，表明KIF15在肝癌细胞的侵袭过程中发挥了一定的促进作用。在Eskova等[4]的研究中，KIF15介导网格蛋白Dab2在细胞内的定位，调节整合素的内化过程从而影响了细胞的侵袭能力。Wang等[25]也发现KIF15通过激活MEK-ERK通路加速了细胞的G1/S期转化，促进了胰腺癌细胞的异常增殖。以上研究结果均提示KIF15在扮演了促进肿瘤进展的角色。
综上所述，KIF15在肝癌的增殖和侵袭过程中发挥了一定的作用，并可以作为判断肝癌患者预后的指标，有望成为肝癌早期诊断的标志物及化疗的潜在靶点，但其促进肝癌细胞侵袭转移的具体机制还需进一步深入研究。
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