胃肠道间质瘤（GIST）是起源于胃肠道肌层的间叶源性肿瘤，发病率约1～2/10 0000，约占胃肠道恶性肿瘤1%～3%[1]。手术治疗是目前主要的治疗手段，但术后仍有40%～80%的GIST患者出现复发[2]。因此，研究GIST发生机制并寻找有效治疗手段迫在眉睫。GIST发生发展过程极其复杂，涉及多种分子信号通路参与。
卷曲螺旋结构域蛋白34（coiled-coil domaincontaining 34，CCDC34）在1例视网膜和视网膜色素上皮联合错构瘤患者中首次发现，也被称为NY-REN-41，包括373个氨基酸，位于11p14.1染色体上。目前研究发现，CCDC34在膀胱癌[3]、宫颈癌[4]、直肠癌[5]和肝癌[6]等多种肿瘤中过表达，促进其细胞增殖和迁移。Hu等[7]在食管鳞状细胞癌中CCDC34差异表达水平与ESCC组织的淋巴结转移和TNM分期显着相关，且高表达CCDC34患者预后不良。除此之外，他们还发现CCDC34和VEGF之间存在明显的相关性。Qi等[8]研究表明在胰腺癌细胞中沉默CCDC34后通过抑制PI3K/Akt信号通路阻滞肿瘤血管生成等作用。由此可以看出CCDC34在肿瘤血管生成中发挥至关重要的作用。然而，CCDC34在GIST中的表达水平和作用尚不清楚，本研究通过分析GIST组织中CCDC34的表达和微血管密度（microvessel density，MVD）的数量，并在荷瘤鼠模型上探讨其对GIST血管生成的作用及机制，为临床治疗GIST，提供理论参考依据。
1 材料与方法
1.1 标本来源
收集2018年1月—2019年2月我院病理科经外科切除的GIST组织标本84例，患者年龄45～79岁，平均（5 5.2 5±7.2 1）岁；肿瘤位于胃4 8 例，小肠2 0 例，结直肠8 例及胃肠外8 例；组织学分型：上皮样细胞型5例，梭形细胞型71例和混合细胞型8例；32例局部侵犯（浸润消化道壁或邻近脏器）；3 1 例有坏死，3 4 例转移（盆腹腔转移1 5 例，肝转移5 例，淋巴结转移4 例）；肿瘤最大径0.4～25 cm。另选取30例正常胃肠道黏膜组织作为对照，所有患者年龄4 6 ～7 8 岁，平均（54.16±5.12）岁。
1.2 实验材料
C C D C 3 4 p c D N A 过表达载体（采用的质粒为pLVX-IRES-Hyg）、CCDC34干扰载体（采用pRNAT-u6.2载体），其对应的包装质粒均由广州锐博生物技术有限公司设计和构建；兔抗CCDC34单克隆抗体、兔抗人C D 3 4 单克隆抗体、兔抗人PI3K单克隆抗体、兔抗人p-Akt单克隆抗体、兔抗人VEGF-C单克隆抗体、HRP标记的兔二抗购自英国Abcam公司；蛋白提取试剂盒、BCA试剂盒、DAB免疫组织化学显色试剂盒、发光试剂盒、潮霉素B、遗传霉素购自生工生物工程（上海）股份有限公司；293T和GIST882细胞株购自上海研生实业有限公司。4周龄雄性BALB/c裸鼠，体质量为12～15 g，购买于南京大学模式动物研究所。TransLvTM Lentivirus qPCR Titration Kit购自北京全式金生物技术有限公司。Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司
1.3 免疫组化检测染色及结果判读
1.3.1 免疫组化检测 经常规石蜡包埋标本，制备5 μm 厚连续切片。3%H2O2 10 min 阻断内源性过氧化物酶，正常家兔血清室温封闭10 min，加入一抗于4 ℃孵育过夜。次日，PBS 冲洗3 次，生物素化羊抗兔二抗37 ℃孵育30 min，PBS 冲洗3 次，辣根酶标记链酶卵白素37 ℃孵育45 min，漂洗后DAB 显色，苏木素复染封片，中性树脂封片，镜下观察并获得图像。
1.3.2 结果判定 以胞质出现浅黄色至棕褐色者为阳性，染色强度评分标准为基本不着色记0 分，浅黄色记1 分，棕黄色记2 分，棕褐色记3 分；阳性细胞所占比例评分标准为：0%记0 分，1%～25%记1 分，26%～50% 记2 分，51%～75% 记3 分，76%～100% 记4 分。两项指标评分乘积，判定结果如下：阴性为0～3 分、4～12 分为阳性。以不含一抗的标本作为阴性对照。
1.3.3 MVD 计数 肿瘤边缘区微脉管计数采用郭黎姣等[8]的方法。用CD34 标记微血管，先于40 倍光镜下选出3 个微血管着色最密集的区域，然后在200 倍视野下计数微血管。判定结果如下：被抗体染色的细胞或细胞团记为1 个微血管，排除管径＞8 个红细胞直径及汇管区血管。MVD 数量为3 个视野的均值。
1.4 CCDC34 干扰/ 过表达GIST882 稳定转染细胞株的建立
1.4.1 CCDC34 过表达GIST882 稳定转染细胞株的建立 具体步骤参照文献[9]，将包装质粒1、2 和CCDC34 pcDNA 过表达载体按照5:3:2 比例加入到opti-MEM 中混匀，另用转染试剂PEI 将opti-MEM 预混。室温静置20 min 后，将两者混合。缓慢加入293T 细胞中。分别于24、48 h 收集2 次病毒备用，采用TransLvTM Lentivirus qPCR Titration Kit 检测慢病毒的滴度。将获得的病毒感染SKOV3 细胞（MOI=20），采用潮霉素B 进行筛选出CCDC34 过表达GIST882 稳定转染细胞株。
1.4.2 CCDC34 干扰GIST882 稳定转染细胞株的建立 基本操作如1.4.1。最后采用遗传霉素进行筛选出CCDC34 干扰GIST882 稳定转染细胞株。
1.5 动物造模及分组
将无处理的G I S T 8 8 2 及C C D C 3 4 干扰/过表达GIST882细胞株于培养基中培养传代后，调整密度为1×107个/mL，在裸鼠第二乳垫部皮下注射0.2 m L 细胞液，建立6 0 只荷瘤鼠，分为模型组（无处理的GIST882细胞）、CCDC34干扰组（CCDC34干扰GIST882细胞）和CCDC34过表达组（CCDC34过表达GIST882细胞），每组各 20只。在接种部位乳垫处出现质地较硬，肿瘤结节认为造模成功。3周后处死裸鼠，完整切除肿瘤组织。
1.6 Western blot 实验
收集各组细胞/组织裂解，用BCA定量裂解的蛋白，进行SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉封闭。用一抗在室温下孵育2 h、洗膜；用羊抗兔HRP二抗在室温下孵育1 h、洗膜，ECL显影。化学发光系统拍照。
1.7 统计学处理
所有的数据均采用SPSS 21.0软件进行分析。计量资料用均数±标准差（x±s）表示，符合正态分布的计量资料，两组比较采用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析；计数资料用例数（百分比）[n（%）]表示，组间率的比较采用χ2检验；相关性分析采用Pearson相关分析法，检验水准α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 GIST 组织和正常胃肠道黏膜组织CCDC34表达
免疫组化染色显示，CCDC34在GIST组织中的阳性表达率（86.90%，73/84）明显高于正常胃肠道黏膜组织的（16.67%，5/30）（χ2=98.175，P=0.001）（图1）。
图1 免疫组化检测CCDC34 表达 A：正常胃肠道黏膜组织（×100）；B：GIST 组织（×100）；C：正常胃肠道黏膜组织（×200）；D：GIST 组织（×200）
Figure 1 Immunohistochemical staining for CCDC34 expression A: Normal gastrointestinal mucosal tissue (×100); B: GIST tissue (×100); C: Normal gastrointestinal mucosal tissue (×200); D: GIST tissue (×200)
2.2 CCDC34 表达与GIST 患者临床病理特征的关联性
CCDC34表达与患者性别、年龄、肿瘤部位、组织学类型等无关（均P＞0.05），而与肿瘤的危险度分级、肿瘤大小、肿瘤细胞核分裂象和局部侵犯、坏死和转移有关（均P＜0.05）（表1）。
2.3 GIST 组织中的CCDC34 与MVD 计数的相关性
S p e a r m a n 相关分析表明，C C D C 3 4 表达与M V D 计数呈现明显的正相关性（r=0.6 9 5，P＜0.001）（图2）。
2.4 转染效率检测结果
与空白对照组比较，CCDC34干扰组GIST882细胞CCDC34蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）。CCDC34过表达组GIST882细胞CCDC34蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）。CCDC34的蛋白表达在空白对照组、干扰对照组和过表达对照组无统计学差异（均P＞0.05）（图3）。
表1 CCDC34 表达与GIST 患者临床病理特征的关系[n（%）]
Table 1 Relations of CCDC34 expression with the clinicopathologic characteristics of the GIST patients [n (%)]
图2 CCDC34 表达与MVD 计数的关系 A：在GIST 组织CCDC34 表达量与MVD 计数值散点图；B：GIST 组织中的CCDC34 与MVD 计数之间的相关性散点图
Figure 2 Relationship between CCDC34 expression and MVD count A: Scatter plot of CCDC34 expression levels and MVD counts in GIST tissues; B: Scatter plot of correlation between CCDC34 expression and MVD count in GIST tissues
图3 Western blot 检测转染效率
Figure 3 Transfection efficiency detected by Western blot analysis
2.5 各组移植瘤MVD 计数值比较
以C D 3 4 标记的微血管进行M V D 计数值分析，结果显示，与模型组移植瘤M V D 计数（1 8.5 2±3.2 6）比较，C C D C 3 4 过表达组裸鼠移植瘤M V D 计数（2 9.5 6±2.4 9）明显增加（t=11.63，P＜0.01）；CCDC34干扰组裸鼠移植瘤MVD计数（6.21±1.52）明显降低（t=14.64，P＜0.01）（图4）。
图4 各组移植瘤MVD 计数检测（×200） A：模型组；B：CCDC34 过表达组；C：CCDC34 干扰组
Figure 4 Detection of MVD counts in the tumor xenografts of each group A: Model group; B: CCDC34 overexpression group; C: CCDC34 interference group
2.6 各组移植瘤组织中PI3K、p-Akt、VEGF-C表达
与模型组比较，C C D C 3 4 过表达组移植瘤组织中P I 3 K、p-A k t、V E G F-C 明显增加（均P＜0.05）；CCDC34干扰组移植瘤组织中PI3K、p-Akt、VEGF-C明显降低（均P＜0.05）（图5）。
图5 各组移植瘤组织中PI3K、p-Akt、VEGF-C 表达比较
Figure 5 Comparison of expressions of PI3K, p-Akt and VEGF-C in tumor tissues of each group
3 讨 论
卷曲螺旋（coiled-coil）是一种在蛋白质中鉴定出来的特殊结构基序。该结构基序参与一系列生物学功能，如细胞分裂，基因表达调控，药物传递和膜融合[10]。研究[10-12]表明，含有该结构基序的蛋白质在结直肠癌、胰腺癌等多种肿瘤中异常表达，与肿瘤细胞的迁移，侵袭和转移密切相关，有望成为肿瘤侵袭和转移以及临床判断肿瘤治疗预后的新标志物。CCDC34是卷曲螺旋结构域（CCDC）家族的新成员之一，是与疾病有关的蛋白质编码基因[5, 13]。CCDC34的临床意义首先在膀胱癌中被探索，结果表明，CCDC34在膀胱癌中表达上调，通过慢病毒介导的sgRNA敲低CCDC34可以抑制膀胱癌细胞的增殖和迁移，并促进细胞周期保持在G2/M阶段。此外，CCDC34的敲低显着抑制裸鼠中膀胱肿瘤细胞的生长[3]。在食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）中，CCDC34差异表达水平与ESCC组织的淋巴结转移和TNM分期显着相关，且CCDC34高表达的患者的总生存率（O S）和无病生存率（DFS）显著低于CCDC34低表达的患者。因此CCDC34表达水平可作为ESCC患者OS和DFS的独立预后因素[7]。本研究首次证明CCDC34在GIST患者中与正常胃肠道黏膜组织相比高表达。然后，分析结果显示，CCDC34表达与患者性别、年龄、肿瘤部位、组织学类型等无关，而与肿瘤的危险度分级、肿瘤大小、肿瘤细胞核分裂象和局部侵犯、坏死和转移密切相关。这与张著学等[14]和李小红等[15]研究结果相似，说明CCDC34有可能参与GIST的侵袭与进展。
目前，已有研究[16-17]表明血管生成对肿瘤的发生，发展和转移至关重要。抗血管生成药物及其类似物的研发应用，为肿瘤的治疗提供了新的方法[18-20]。Qi等[8]研究表明在胰腺癌细胞中沉默CCDC34后可通过抑制PI3K/Akt信号通路阻滞肿瘤血管生成等作用。由此可以看出CCDC34参与胰腺癌血管生成。本研究为了确定在GIST中CCDC34蛋白与肿瘤血管生成之间是否存在联系，先分析MVD和CCDC34之间的关系。与MVD计数呈正相关的结果表明，两者具有正相关关系。这与李泓享等[21]和范晓杰等[22]研究结果相似，提示CCDC34可能通过参与了肿瘤微血管的生成。再通过动物实验发现，与模型组相比，CCDC34干扰组显著降低肿瘤血管生成及PI3K、p-Akt、VEGF-C蛋白表达，而CCDC34过表达组显著提高肿瘤血管生成及PI3K、p-Akt、VEGF-C蛋白表达。本研究与前人研究[23-24]结果相似，由此表明，CCDC34调控PI3K/Akt途径参与胃肠道间质瘤的血管生成。其作用机制为：PI3K信号通路激活后使Akt磷酸化为p-Akt，p-Akt激活内皮型一氧化氮合酶使之磷酸化，产生NO刺激血管舒张和血管形成[25-27]。此外，p-Akt还可通过磷酸化IKKS，降解I-κB，激活NF-κB，从而促进血管生成因子的表达[28-29]。
综上所述，在GIST中过表达CCDC34促进的血管生成，其机制与激活PI3K/Akt信号通路有关，有望成为治疗GIST患者的新靶点。但本研究所得结论只是基于裸鼠动物实验得出，临床中是否具有相同机制还需要进一步探索与研究。
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