甲状腺癌是最常见的内分泌系统恶性肿瘤，近年来，甲状腺癌发病率屡日剧增。甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲状腺癌的常见病理类型，其分化程度较高，恶性程度低，总体预后良好，但侵袭型乳头状甲状腺癌有转移倾向，淋巴结转移较早，约占甲状腺恶性肿瘤的85%[1]。部分基因突变与PTC侵袭性相关，但非编码RNA在PTC发生和转移中的作用机制还不清楚。因此，揭示其潜在的分子机制对于改善PTC患者的病情、预后及术后生活质量至关重要。
miRNA是一种小分子RNA，约由25个核苷酸组成，在早期发育、脂肪代谢、细胞分化等生物学活动中发挥着重要作用[2]。最近研究证明，miRNA的异常表达与恶性肿瘤的发生发展有着密不可分的联系。在肝细胞癌[3-4]、乳腺癌[5-6]、结直肠癌[7]中作为抑癌基因或癌基因参与细胞的增殖、凋亡和侵袭，提示其在肿瘤进展的作用机制中具有重要的研究价值。Cong等[8]检测了肿瘤基因组图谱数据库中近500例PTC标本和60例正常甲状腺标本中miRNA的表达情况，研究显示与正常的甲状腺组织相比，PTC中miR-221表达上调。目前对miR-221作用机制及功能研究较少，本研究旨在探索miR-221的各种生物学行为，并探讨miR-221在PTC发生中可能的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
本实验51对PTC组织及其癌旁正常组织均来自贵州医科大学附属医院。所有标本均在30 min内取材，取得标本后迅速放入液氮罐内冷藏，最后移至到-80 ℃的冰箱储存。所有标本均有完整的临床资料，术前均未进行化疗和放疗。PTC K1细胞系购自上海素尔生物科技有限公司，TRIzol试剂盒购自Ambion公司；HiScript Reverse Transcriptase（RNase H）、5×HiScript Buffer、50×ROX Reference Dye 2和SYBR Green Master Mix购自VAZYME公司；ddH2O（DNase/RNase Free）购自Genecopoeia公司；Ribonuclease Inhibitor、dNTP、Taq Plus DNA Polymerase和DL2000 DNA Marker购自TIANGEN公司；Random Primer（N6）购自AIDLAB公司；引物合成来自擎科公司。DMEM、胎牛血清、青-链霉素双抗、胰蛋白酶-EDTA（0.25%），酚红，No EDTA和Opti-MEM®购自Gibco公司；MTT购自Biosharp公司；lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；周期检测盒购自凯基生物；APC/7-AAD凋亡试剂盒购自三箭。miR-221抑制物阴性对照序列：5'-CAG UAC UUU UGU UGA GUA CAA-3'，miR-221抑制剂序列：5'-GAA ACC CAG CAG ACA AUG UAG CU-3'。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养、细胞转染及分组 PTC K1细胞系用含10%胎牛血清的培养液，于37 ℃ 5% CO2饱和湿度条件下进行培养。取状态良好的处于对数生长期的K1细胞分成3组：空白对照、阴性对照序列转染组（阴性对照组）、miR-221抑制物转染组（miR-221抑制物），接种于96孔板，于37 ℃ 5% CO2培养箱中培养，待细胞生长达70%时，用Lipofectamine 2000分别转染miR-221抑制剂阴性对照和miR-221抑制剂，转染后继续培养相应时间。
1.2.2 qRT-PCR检测甲状腺组织miR-221的表达 按照TRIzol试剂盒说明书提取总RNA，按 照TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for RT-PCR试剂盒说明书对其进行反转录合成cDNA。按照TransStart Green qPCR SuperMix试剂盒说明书进行PCR反应，引物序列如下：U6正向引物：5'-CGC TTC GGC AGC ACA TAT AC-3'，U6反向引物：5'-AAA TAT GGA ACG CTT CAC GA-3'，hsa-miR-221-3p环引物：5'-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACG AAA CCC A-3'，hsa-miR-221-3p正向引物：5'-TGC GCA GCT ACA TTG TCT GCG G-3'，反向引物：5'- CCA GTG CAG GGT CCG AGG TAT T-3'。PCR反应条件是：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40个循环。每个样本重复3次，用ABI QuantStudio 6实时荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR实验。最终数据以2-（△△ct）进行分析。
1.2.3 qRT-PCR检测K1细胞miR-221的表达 按照TRIzol试剂盒说明书从培养细胞中提取总RNA，然后按照TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for RT-PCR试剂盒说明书对其进行反转录合成cDNA。按照TransStart Green qPCR SuperMix试剂盒说明书进行PCR反应，引物序列和PCR反应条件同上。每个样本重复3次，用ABI QuantStudio 6实时荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR实验。最终数据以2-（△△ct）进行分析。
1.2.4 MTT比色法检测细胞增殖 取对数生长期，培育状态良好的K1细胞，接种于96孔板，同时设空白组，阴性对照组、miR-221抑制物组。37 ℃过夜，细胞培养所需时间后，每孔加入10 μL MTT，37 ℃培养4 h，吸出培养基，150 μL DMSO震荡10 min，酶标仪测定各孔吸光值OD568 nm。实验至少重复3次。
1.2.5 流式细胞仪分析细胞周期 分别取对数生长期，培育状态良好的空白对照组、NC转染组、miR-221 inhibitor转染组K1细胞，用0.25%胰酶消化细胞，终止后收集细胞，1 000 r/min，5 min，去上清，PBS重悬润洗2次，1 000 r/min，5 min，去上清，100 μL PBS重悬细胞，缓慢加入700 μL预冷的80%乙醇，使乙醇终浓度为70%，4 ℃固定4 h以上，1 000 r/min，5 min，预 冷PBS润洗2次，加入100 μL RNase（50 μg/mL），37 ℃孵育30 min，加入400 μL PI（50 μg/mL），4 ℃避光染色30 min，流式细胞仪检测。实验至少重复3次。
1.2.6 流式细胞仪分析细胞凋亡率 分别取对数生长期，培育状态良好的空白对照组、NC转染组、miR-221 inhibitor转染组K1细胞，培养所需时间后，进行收集，1 200 r/min，5 min离心，去上清，加PBS重悬，用PBS润洗2次，1 200 r/min，5 min，按照Annexin V-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒操作说明进行，加入500 μL结合缓冲液，重悬细胞，加5 μL Annexin V-APC混匀后加5 μL 7-AAD，混匀，室温避光反应5～15 min（同时设阴性对照，即正常细胞不加Annexin V-APC和7-AAD；以凋亡效果最明显的溶剂组作为阳性对照，设对照组 1和2，对照组1只加5 μL AnnexinV-APC单标；对照组2只加5 μL 7-AAD单标）。上机检测。实验至少重复3次。
1.2.7 Transwell小室检测细胞侵袭力 取处理好的 K1细胞，PBS清洗，0.25%胰酶消化收集，1 000 r/min，5 min离心，去上清，PBS清洗后，DMEM培养基重悬细胞，计数，DMEM培养基稀释细胞浓度至2×104/mL，备用，将 Matrigel在4 ℃提前1 d融化，Transwell小室、24孔培养板和枪头在-20 ℃过夜预冷，用无血清培养基稀释 Matrigel至终浓度1 mg/mL，冰上操作，在24孔板中注入4 ℃预冷800 μL 10% FBS DMEM培养基（含双抗），并放入Transwell小室，在Transwell小室上室底部中央垂直加入100 μL终浓度为 1 mg/mL的Matrigel，37 ℃室温温育成胶状后，在Transwell上室分别接入200 μL各组细胞悬液，37 ℃，5%CO2培养箱培养24 h，取出Transwell，PBS清洗小室，70%冰乙醇固定1 h，染色后，常温静置20 min，PBS清洁，用无污染的棉球将上室一侧的没有迁移的细胞擦净，显微镜下仔细观察并拍照。实验至少重复3次。
1.3 统计学处理
应用SPSS 20.0软件进行处理，所有数据都是以均数±标准差（
±s）方差表达。组间统计学显著性差异使用单因素方差分析或未配对独立样本 t检验。检验水准：α=0.05。
2 结 果
2.1 qRT-PCR检测hsa-miR-221-3p在PTC癌组织及癌旁组织中的表达
PCR结果显示，51例癌组织和癌旁组织的相对表达量分别为1.208 61±0.120 872，0.626 33±0.075 037，癌组织的相对表达量明显高于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1）。
图1 qRT-PCR检测hsa-miR-221-3p的表达
Figure1 The expression of hsa-miR-221-3p was measured by qRT-PCR
A：U6扩增曲线；B：U6溶解曲线；C：hsa-miR-221-3p扩增曲线；D：hsa-miR-221-3p溶解曲线；E：hsa-miR-221-3p相对表达量
A:U6 amplification curve; B:U6 dissolution curve; C:hsa-miR-221-3p amplification curve; D:hsa-miR-221-3p dissolution curve; E:Relative expression levels of hsa-miR-221-3p
2.2 miR-221抑制物下调miR-221的效率
qRT-PCR结果显示，空白对照组、阴性对照组、miR-221抑制物组miR-221相对表达量平均值分别为0.997、0.984、0.277，miR-221抑制物组miR-221的表达量明显低于空白对照组与阴性对照组（均P＜0.05），而后两组间差异无统计学意义（P＞0.05）（图2）。
2.3 miR-221对PTC细胞增殖能力的影响
MTT实验结果显示在同一时间，miR-221抑制物组较其他组吸光值明显降低（均P＜0.05），而阴性对照组与空白对照组间差异无统计学意义（P＞0.05）（图3）。各组增殖率为：空白对照组100.00%、阴性对照组97.89%、miR-221抑制物组61.77%。
图2 miR-221 inhibitor的下调效率
Figure2 The downregulation efficiency of miR-221 inhibitor
A：U6扩增曲线；B：U6溶解曲线；C：hsa-miR-221-3p扩增曲线；D：hsa-miR-221-3p溶解曲线；E：hsa-miR-221-3p相对表达量
A:U6 amplification curve; B:U6 dissolution curve; C:hsa-miR-221-3p amplification curve; D:hsa-miR-221-3p dissolution curve; E:Relative expression levels of hsa-miR-221-3p
图3 miR-221对甲状腺乳头状癌细胞增殖的影响
Figure3 Effect of miR-221 on proliferation of papillary thyroid cancer cells
2.4 miR-221对PTC细胞凋亡和周期的影响
3次凋亡实验显示，空白对照组凋亡率分别为7.40%、6.58%、6.71%；阴性对照组凋亡率分别为6.79%、6.42%、6.72%；miR-221抑制物组凋亡率分别为23.43%、25.03%、24.77%，miR-221抑制物组较空白对照组与阴性对照组凋亡比例明显增加（均P＜0.05），而阴性对照组与空白对照组的凋亡率无统计学差异（P＞0.05）（图4）。细胞周期实验显示，miR-221抑制物组G0/G1期比例较空白对照组与阴性对照组转染组，而G2/M期的比例较空白对照组与阴性对照组转染组明显降低（均P＜0.05），而阴性对照组与空白对照组的细胞周期分布无统计学差异（P＞0.05）（图5）。
2.5 miR-221对PTC细胞侵袭能力的影响
侵袭实验中，每组设3个平行样本，每个样本观测5个视野（×200），空白对照组、阴性对照组、miR-221抑制物组的平均侵袭数为49.2、50.0、33.2，miR-221抑制物组较空白对照组与阴性对照组平均侵袭数明显减少（均P＜0.05），而后两组间差异无统计学意义（图6）。
图4 miR-221对PTC细胞凋亡的影响
Figure4 Influence of miR-221 on apoptosis of PTC cells
图5 miR-221对PTC细胞周期的影响
Figure5 Influence of miR-221 on cell cycle of PTC cells
图6 miR-221对PTC细胞侵袭的影响
Figure6 Influence of miR-221 on the invasion ability of PTC cells
3 讨 论
miR-221在许多肿瘤中均表达出了致癌性。通过数据库检索显示，在成胶质细胞瘤[9]、肝细胞癌[10]、乳腺癌[11]、宫颈癌[12]、卵巢癌[13]、黑色素瘤[14]、甲状腺癌[15-16]、前列腺癌[17]中miR-221通过异常高表达促进了肿瘤细胞的恶性增殖、免疫逃逸、侵袭和转移。但是，在一些其他肿瘤中 miR-221也表达出了抑癌性。例如，miR-221通过靶向Ecm29，减弱了前列腺癌PCa细胞的迁移和侵袭[18]。miR-221通过针对红白血病细胞和胃肠道间质肿瘤中的Kit，从而抑制了癌细胞增殖并诱导了细胞凋亡[19]。此外，Okamoto等[20]发现miR-221在人胆管癌细胞中通过靶向调节亚基1（PIK3R1）的磷酸肌醇3激酶，从而抑制HuH28细胞增殖并赋予Gem敏感性。表明在不同肿瘤中，miR-221所起到的作用可能完全不同。
近些年来，通过对甲状腺癌的研究发现，不同病理类型的甲状腺癌发生与发展均和miRNA有着密切的关系。本研究发现，甲状腺乳头状癌组织及甲状腺乳头状癌细胞中miR-221表达明显上调，与Cerutti等[21]研究结果一致，认为PTC组织中miR-221的表达相比正常甲状腺组织显著增加。上述分析结果通过Northern印迹法和RT-PCR被进一步证实。此外，在甲状腺结节细针穿刺细胞学检查发现，miR-221过表达的甲状腺结节，经外科手术取活检后被最终确诊为PTC[21]。人类PTC来源的细胞系中通过阻断过表达的发现，miR-221的过度表达在PTC癌变中起关键作用。在FTC中，研究发现miR-197和miR-346表达的增加有助于FTC的发生，它可能通过干扰基因表达而起作用[22]。而miR-221虽然与PTC的致癌作用相关，但与FTC的发展无明显相关性[23]。在甲状腺未分化癌中，通过miRNA芯片微阵列分析ATC的miRNA发现，与正常甲状腺组织相比，miR-26a、miR-30d、miR-125b、miR-30a-5P的表达显著减少[24]，而miR-221并未在ATC中上调[25]。在MTC中，miRNA的报道较为少见，仅有的报道中也并未显示miR-221和MTC的关系。目前的研究表明，miR-221作为一种致癌基因参与了甲状腺癌的发生和发展。
在PTC体外实验中，本研究发现miR-221较正常甲状腺组织明显高表达，通过向K1细胞系转染miR-221抑制物后，发现细胞增殖能力显著降低，细胞凋亡率显著升高，细胞生长周期明显延长，侵袭能力显著降低，表明miR-221促进了K1细胞的增殖和侵袭能力，降低了凋亡能力和细胞周期。
PI3K/Akt起始的细胞途径受到癌基因或抑癌基因的正向或负向控制，而这些基因又被增强或受多种因素（例如miRNA）抑制[26]。磷酸酶张力蛋白同源物（PTEN）在调节细胞黏附，增殖和迁移的信号通路中起到至关重要的作用。PTEN是包括肝癌在内的多种癌症的肿瘤抑制因子，他影响Akt和ERK信号通路[27]。据报道，在许多人类癌症中，miR-221通过下调PTEN来增强Akt的磷酸化[28]。 在胃癌细胞中，miR-221簇已显示出靶向肿瘤抑制基因PTEN，导致癌细胞增殖和放射抗性增加[29]。由于PTEN是miR-221的潜在靶标[30]，因此miR-221可能和Akt通路的增强存在联系。因此笔者推测，miR-221对PTC增殖、凋亡、侵袭的影响可能与下调PTEN从而增强Akt信号通路有关。本研究存在着一定的欠缺和不足，虽然本研究探讨了miR-221在PTC发生和发展中的作用，但对于它产生作用的机制并没有做更进一步的实验研究，只能通过往期的报道来进行粗略的预测。
本研究发现miR-221在PTC组织及细胞中呈高表达；术前检测miR-221的表达状态对于提高甲状腺癌诊断率可能具有重要意义。抑制miR-221表达明显抑制PTC K1细胞株的增殖、促进细胞株的凋亡和降低细胞株的侵袭性。为侵袭性PTC的靶基因治疗提供了一定的理论依据。
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