随着外科技术的提高以及围术期管理的日趋完善，胰十二指肠切除术（pancreaticoduodenectomy，PD）的病死率已降至5%以下，但术后胰瘘（postoperative pancreatic fistula，POPF）的发生率仍高达20%～40%[1-4]，严重影响患者的术后恢复，甚至影响远期生存率。研究[5]表明，质软胰腺是发生POPF的重要的危险因素之一。然而，胰腺质地的判断往往凭借医生的主观感受，缺乏客观的评价依据。胰腺星状细胞（pancreatic stellate cells，PSC）与胰腺的纤维化密切相关[6-7]。PSC的活跃度能否用来预测POPF，目前尚无研究报道。本研究前瞻性收集中南大学湘雅医院2017年 12月—2019年9月间101例PD术患者资料，通过分析胰腺切缘组织中PSC的活跃度，探讨PSC的活跃度在PD术后POPF中的预测价值。
1 资料与方法
1.1 一般资料
前瞻性收集2017年12月—2019年9月间中南大学湘雅医院连续收治的101例行PD术的患者，其中男55例（54.5%），女46例（45.5%）；年 龄27 ～81岁，中位年龄56 岁；开腹手术96例（95.0%），腹腔镜手术5例（5.0%）；经典PD 95例（94.0%），保留幽门的PD（pyloruspreserving PD，PPPD）6例（6.0%）；病理类型包括十二指肠乳头癌36例（35.6%），胰腺癌 28例（27.6%），胆总管下段癌11例（10.8%），胰腺囊性肿瘤7例（7.0%），壶腹癌6例（6.0%），慢性胰腺炎6例（6.0%），十二指肠或胰腺间叶源性肿瘤5例（5.0%），胰腺神经内分泌肿瘤1例（1.0%），胆总管炎性狭窄1例（1.0%）。
1.2 染色方法及PSC 活跃度分级
取PD 手术中胰腺颈部切缘处胰腺组织行α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）免疫组化染色。取该处胰腺组织石蜡块予以切片、脱蜡后，将其置于柠檬酸钠缓冲溶液（0.01 mol/L，pH6.0）中高压环境（125 ℃， 131 kPa）约15 min以修复抗原。3%H2O2溶液消除内源性过氧化物酶的活性。一抗（鼠抗人单克隆平滑肌肌动蛋白抗体1A4，稀释浓度1∶50），湿盒持续4 ℃孵育过夜。二抗（羊抗鼠单克隆抗体）湿盒孵育，在4 ℃下放置约20～30 min，二氨基联苯胺和苏木精分别进行显色和复染，完成染色。
参考Tanaka等[8]的分级方法，由胰腺病理专家盲法阅片，将α-SMA 免疫组化染色强度分为阴性（-）、弱阳性（+）、中阳性（++）和强阳性（+++）4个等级，分别对应0级（S0）、1级（S1）、2级（S2）、3级（S3）对PSC活跃度进行量化，其具体评判细则如表1所示。
表1 PSC 活跃度的分级标准
Table 1 The grading criteria for PSC activity
PSC 活跃等级 评判细则S0 除胰管周围组织外，无胰腺组织染色，胰腺结构正常S1 一般阳性染色，分布不规则，呈小块斑片状，无明显胰腺结构改变S2 中度阳性染色，分布不均匀，主要位于胰腺小叶内及小叶间，伴腺泡细胞轻度萎缩S3 强阳性染色，分布均匀而弥漫，伴明显腺泡细胞萎缩、小叶结构广泛破坏
本研究中所有的临床数据、标本的收集均获得患者的知情同意，并签署书面同意书。本研究获得中南大学湘雅医院医学伦理委员会批准进行（项目编号：201707777）。
1.3 围术期管理
术后常规预防性使用抗生素以及营养支持等治疗。PD患者术后的腹腔引流管均采用延迟性拔管策略（留置时间≥7 d），并常规于术后第1、3、7天动态监测腹腔引流液淀粉酶（drainage fluid amylase，DFA）情况。对于术后7 d或以后的DFA处于正常范围，且引流管引流量＜10 m L/d 的患者，考虑拔除腹腔引流管。所有患者均采取快速康复外科模式促进患者早期恢复[9]。
1.4 POPF 的定义及诊断标准
临床相关性胰瘘（clinically relevant POPF，C R-POPF）的诊断标准参照2016年版胰腺外科国际研究小组[10]（International Study Group of Pancreatic Surgery，ISGPS）的定义：术后＞3 d时，DFA大于血清淀粉酶正常值上限的3倍，且与临床治疗及预后相关。在此前提下，仅包括B级和C级CR-POPF，而生化漏（biochemical leakage）不包括在内。生化漏：仅术后第3天或以后腹腔引流液淀粉酶升高达正常值上限3倍，而对临床结局无任何影响。B级CR-POPF：(1) 腹腔引流管留置时间＞3周；(2) POPF相关性临床治疗方案变更（加用生长抑素、抗生素升级、肠内外营养支持、输血等）；(3) 需经皮或内镜下穿刺引流的POPF继发性胰周积液；(4) 需血管造影介入止血的POPF相关性出血；(5) POPF继发性感染，但无脏器功能衰竭。满足以上5种情况中的任意1种。C级CRPOPF：(1) 需再次开放手术处理的POPF相关并发症（如假性动脉瘤破裂出血、腹腔脓肿形成、吻合口破裂等）；(2) POPF继发性器官功能衰竭；(3) POPF相关性死亡。满足以上3种情况中的任意 1种。
1.5 统计学处理
计数资料以例数（百分比）[n（%）]表示，其比较采用χ2检验；计量资料中符合正态分布的数据以均数±标准差（
±s）表示，其比较采用 t 检验；符合偏态分布的数据以中位数（M）表示，其比较采用Mann-Whitney U检验。多因素分析采用Logistic回归模型，并应用受试者操作特性曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）进行分析。以上均通过SPSS 22.0统计软件分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 手术结果
全组101例患者中，41例术后出现CR-POPF，CR-POPF发生率为40.6%，包括B级36例，C 级 5例。无CR-POPF者共60例，包括19例生化漏和41例无胰瘘者。中位手术时长与术中出血量分别为340 min和400 mL。术后总的并发症率为46.5%（47/101），除C R-POPF 外，包括术后胆汁漏 7例（7.0%），延迟性胃排空障碍4例（4.0%），术后出血（包括消化道出血和腹腔内出血）16例（15.8%）和肺部并发症（包括胸腔积液、肺部感染、肺不张及呼吸功能衰竭等）46例（45.5%）。术后中位住院时长为15 d，再入院率为6.0%（6/101），术后90 d内病死率为4.0%（4/101）。
2.2 PSC 活跃度分级
本研究中，切缘处胰腺免疫组化染色的镜下表现及分级如图1 所示。依照评判规则，全组被分级为S0、S1、S2、S3的病例分别为9、49、24、19例，各活跃度等级中的CR-POPF率分别为88.9%（8/9）、57.1%（28/49）、16.7%（4/24）和5.3%（1/19） ，呈逐渐递减趋势，差异有统计学意义（P＜0.001）。PSC等级与胰腺质地之间的关系如表2所示。在不同的胰腺质地之间，PSC等级的分布具有明显差异性（P＜0.001）。其中，在柔软胰腺中占比最高的PSC等级为S1（60.6%），而在质硬胰腺中为S2（40.0%）。经Spearman相关性检验结果显示，PSC活跃度与胰腺质地的硬度之间存在明显正相关性（r=0.456，P＜0.001），而与CR-POPF之间则存在明显负相关性（r=-0.539，P＜0.001）。
图1 α-SMA 免疫组化染色所反映的PSC 的活跃度 A：S0；B：S1；C：S2；D：S3
Figure 1 The PSC activity shown by immunohistochemical staining of α-SMA A: S0; B: S1; C: S2; D: S3
表2 PSC 等级与胰腺质地之间的关系[n（%）]
Table 2 Relationship between the PSC activity grade and pancreatic texture [n (%)]
PSC 等级 胰腺质地软硬S0 9（13.6） 0（0.0）S1 40（60.6） 9（25.7）S2 10（15.2） 14（40.0）S3 7（10.6） 12（34.3）
2.3 临床病理因素与CR-POPF 关系的单因素和多元回归分析
单因素分析显示，胰腺质地、肿块病理、PSC活跃度分级、体质量指数（BMI）、胰管直径、术前总胆红素、术后第1 天引流液中淀粉酶含量（DFA1）均与CR-POPF的发生有关（均P＜0.05）（表3）。多元回归分析显示，仅PSC活跃度分级（OR=0.24，95% CI=0.10～0.56，P＜0.001）和术前总胆红素水平（OR=1.01，95% CI=1.00～1.01，P=0.008）是预测CR-POPF的独立危险因素（表4）。
2.4 PSC 活跃度分级对CR-POPF 的预测价值
PSC活跃度分级预测CR-POPF的ROC曲线如图2 所示。当截断值取1.5 时，其曲线下面积（area under curve，AUC）为0.795（95% CI=0.708～0.881），相应的敏感度和特异度分别为63.3%和87.8%，提示其对CR-POPF具有良好的预测价值。
表3 临床病理因素与CR-POPF 关系的单因素分析
Table 3 Univariate analysis of relationship between clinicopathologic factors and CR-POPF
因素 CR-POPF 组（n=41）无CR-POPF 组（n=60） P 因素 CR-POPF 组（n=41）无CR-POPF 组（n=60） P性别[n（%）] 胰肠吻合方式[n（%）] 男 22（53.7） 33（55.0） 1.000 端-端吻合 36（87.8） 57（95.0） 0.347 女 19（46.3） 27（45.0） 端-侧吻合 5（12.2） 3（5.0）年龄（岁，images/BZ_33_1708_490_1742_536.png±s） 59.4±10.0 56.1±10.1 0.108 门静脉/肠系膜血管切除重建[n（%）]术前BMI（kg/m2，images/BZ_33_1708_490_1742_536.png±s） 22.77±2.24 21.53±2.65 0.016 有 2（4.9） 3（5.0） 1.000胰管直径（mm，images/BZ_33_1708_490_1742_536.png±s） 2.98±2.01 4.76±2.82 ＜0.001 无 39（95.1） 57（95.0）术中失血量（mL，images/BZ_33_1708_490_1742_536.png±s） 495.6±235.8 472.5±303.0 0.682 预防性使用生长抑[n（%）]手术时长（min，images/BZ_33_1708_490_1742_536.png±s） 364.0±107.8 367.5±122.1 0.884 是 27（65.9） 42（70.0） 0.670术前总胆红素 [μmol/L，M（范围）] 120.9（4.3～305.2） 40.8（5.4～396.3） 0.031 否 14（34.1） 18（30.0）胰腺质地[n（%）]术前血清白蛋白（g/L，images/BZ_33_1708_490_1742_536.png±s） 38.9±4.4 38.8±4.9 0.958 软 36（87.8） 30（50.0） ＜0.001术后血清白蛋白（g/L，images/BZ_33_1708_490_1742_536.png±s） 32.0±5.6 33.6±4.6 0.118 硬 5（12.2） 30（50.0）DFA1 [U/L，M（范围）] 5660.6（32.6～29139.7） 994.6（4.7～25601.5） 0.002 肿块病理[n（%）]ASA 分级[n（%）] 胰腺癌 7（17.1） 21（35.0）0.018 I～II 20（48.8） 37（61.7） 0.225 壶腹癌 2（4.9） 4（6.7） III～IV 21（51.2） 23（38.3） 胆总管下段癌 10（24.4） 1（1.7）术前糖尿病[n（%）] 十二指肠乳头癌 16（39.0） 20（33.3） 有 7（17.1） 12（20.0） 0.799 慢性胰腺炎 1（2.4） 5（8.3） 无 34（82.9） 48（80.0） 胰腺囊性肿瘤 2（4.9） 5（8.3）术前吸烟史[n（%）] 其他 3（7.3） 4（6.7） 有 12（29.3） 20（33.3） 0.828 PSC 活跃度分级[n（%）] 无 29（70.7） 40（66.7） S0 8（19.5） 1（1.7）腹部手术史[n（%）] S1 28（68.3） 21（35.0） ＜0.001 有 9（22.0） 14（23.3） 1.000 S2 4（9.8） 20（33.3） 无 32（78.0） 46（76.7） S3 1（2.4） 18（30.0）手术方式[n（%）] PD 36（87.8） 59（98.3） 0.077 PPPD 5（12.2） 1（1.7）
表4 临床病理因素与CR-POPF 关系多因素Logistic 回归分析
Table 4 Multivariate Logistic regression analysis of relationship between clinicopathologic factors and CR-POPF
因素 OR 95% CI PBMI 1.15 0.91～1.45 0.224胰腺质地（软） 2.39 0.55～9.28 0.245肿块病理 1.88 0.44～8.08 0.357胰管直径 0.98 0.75～1.28 0.428术前总胆红素 1.01 1.00～1.01 0.008 DFA1 1.00 1.00～1.00 0.441 PSC 活跃度分级 0.24 0.10～0.56 ＜0.001
3 讨 论
图2 PSC 等级预测PD 术后CR-POPF 的ROC 曲线
Figure 2 ROC curve of PSC activity for predicting CR-POPF following PD
POPF是PD术后的严重并发症之一，可继发引起术后出血、腹腔感染、延迟性胃排空障碍等一系列并发症，甚至导致患者死亡[11-15]。胰腺质地与POPF的发生密切相关[5,16]。然而，仅靠外科医生的触感判断胰腺质地较为主观。因此，国内外均有研究采用其它较为客观的方法来评判胰腺质地，如MRI、胰腺弹力仪等，取得一定效果，但实用性不高[17-21]。PSC作为胰腺实质中的基质细胞，活化后可分泌大量纤维组织，从而参与胰腺组织的纤维化，理论上可能与胰腺质地变硬密切相关[6-7,21-22]。本研究采用免疫组化检测胰腺切缘组织中的α-SMA蛋白反映PSC的活跃度，前瞻性研究101例PD患者的临床资料，发现PSC活跃度是预测CR-POPF的独立危险因素（OR=0.24，95% CI=0.10～0.56，P＜0.001）。此外，ROC曲线分析显示PSC活跃度的预测效能良好（AUC=0.795），从而进一步证实 PSC活跃度是预测PD术后胰瘘的重要的客观指标。
PSC是一种外形类似星形的胰腺基质细胞，最初于1998年被发现并分离培养[23-24]。它存在于胰腺腺泡细胞、微血管及微胰管周围。在大多数情况下，PSC处于静止态，具有免疫调节、吞噬、储存脂质、维持胰腺组织基础内外分泌以及其基本结构等功能[25-26]。然而，在缺氧、酒精、吸烟等恶劣条件刺激下，PSC可转为活化态并获得成纤维细胞样表型[27-30]，分泌大量细胞因子（如TNF-α，TGF-β、PDGF等）以及细胞外基质，促进胰腺组织的纤维化进程[7,31]。较为特殊的是，慢性胰腺炎的胰腺组织中有大量单核细胞浸润，后者通过产生TNF-α促进PSC活化[32]；胰腺癌细胞与PSC存在纤维化/缺氧循环机制[33]，通过正反馈放大作用致使组织持续性的缺氧、缺血、纤维化。以上可能是PSC介导胰腺纤维化的主要机制。然而，其更具体的分子信号通路仍有待于进一步探究。
从组织病理学角度来看，胰腺质地取决于组织中的纤维化程度，它与胰腺的外分泌功能呈负相关性[22,34]。然而究其根本，胰腺纤维组织的蓄积是PSC活跃的结果，故后者更能反映胰腺质地变化的本质。遗憾的是，目前的研究主要集中于探索胰腺纤维化与胰瘘的联系[35-37]，而鲜有关于PSC活跃度和POPF关联性的研究。Erkan等[38]认为胰腺癌中的PSC是导致胰腺纤维化的主要原因，可影响外科医生对质地的判断。Tanaka等[8]通过将不同活跃程度的PSC进行分级并对CR-POPF进行预测，率先证实PSC等级在发生POPF与无POPF的患者之间存在统计学差异（P=0.035）。在此基础上，本研究发现随着PSC活跃度提高，CR-POPF率明显降低，这与前述的理论基本契合。而且，在本研究中，PSC活跃度被证实是发生CR-POPF的独立危险因素，而胰腺质地并不是独立的危险因素，从而证实了PSC活跃度在预测CR-POPF方面更具有客观性与优越性。因此，PSC活跃度可代替胰腺质地，作为评估CR-POPF风险的全新预测指标。
本研究存在一定的局限性。首先，本研究所涵盖的样本量不大，且为单中心研究；其次，PSC活跃时分泌或活化的蛋白种类繁多，其特征性蛋白除α-SMA外[39]，还包括成纤维细胞活化蛋白-α，潜在转化生长因子结合蛋白等[40-41]。本研究中的标记蛋白较为单一，其客观度稍显不足，有待于在今后的实验中予以完善。
综上所述，PSC的活跃度对CR-POPF的预测具有重要意义，可作为临床指导预测CR-POPF发生的重要参考指标之一。
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