胆囊结石疾病作为极为常见的消化系统疾病，在西方人群发病率为10%～20%[1]，我国目前已经接近发达国家水平，达到8%～10%，该病是由于胆固醇代谢的平衡紊乱所引起[2]。目前对于该疾病的医疗花费已经呈现逐年增长的趋势[3]。尽管已有大量研究[4-6]从基因组学、表观遗传学的角度探索胆囊结石的成因，但目前对胆囊结石形成的分子机制仍不十分明确。结石形成的相关危险因素包括，肥胖、2型糖尿病及胰岛素分泌紊乱等。因此，越来越多研究者[7-9]支持胆囊结石作为一个代谢综合征性质的疾病影响患者健康及生活质量。越来越多的研究[10-11]开始关注在表观遗传领域，即环境因素的改变影响基因组的表达与功能从而最终影响胆囊结石的生成。
酰基胆碱水解酶（cholinesterase，ChE）是一类在体内催化酰基胆碱水解的酶类。ChE以两种形式存在于体内：其一为乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE），主要分布在神经组织中；其二为丁酰胆碱酯酶（butyrylcholinesterase，BChE），作为已被公认的重要脂肪代谢调控参与者，其主要分布在肠黏膜、肝脏、胰腺和血浆中，大量研究已确立了BChE与异常的脂肪代谢具有重要关联。这种联系在糖尿病患者、脂肪肝患者和超重患者中尤为明显，表现为血清总胆碱酯酶均升高[12-13]。作为肥胖相关基因，BChE的表达异常与脂质代谢失常有明显的关系，而胆囊结石疾病作为代谢异常综合征已被证明与肥胖密切相关[14-15]。目前尚未有发表任何关于肥胖相关基因BChE rs1126680以及rs1803274单核苷酸多态性（SNP）突变与胆囊结石发病风险相关的研究。在贵州地区汉族人群中这些SNP与胆囊结石的发病风险相关性就更不明确。本研究在受试人群中筛选BChE rs1126680以及rs1803274两个突变位点与人群中的年龄、性别、体质量指数（BMI）状态进行相关性分析。最后通过TaqMan® SNP基因分型工具对收集的样本进行分型检测，以期探讨这两个位点SNP在受试人群中对胆囊结石发病的影响。
1 资料与方法
1.1 研究对象
所有的胆囊结石疾病病例和健康对照样本分别来源于2013—2016年贵州医科大学附属医院肝胆外科因胆囊结石疾病进行住院治疗的患者，以及于贵州医科大学附属医院体检中心进行体检的健康人群。研究协议及试验流程经贵州医科大学附属医院伦理委员会批准并进行全程监督（伦理批准号：GYGDWK-01），整项研究获得所有受检测参与者的书面知情同意。从296例受试者中获得其合格的全血样品，其中包括胆囊结石疾病患者171例，健康对照组人群125例。合并有肝、肾及内分泌系统疾病的胆囊结石患者不被纳入该项研究。患者及健康体检者入组后，均签署知情同意书，采全血样本10 mL，提取DNA。
1.2 研究方法
1.2.1 人基因组DNA 的提取及纯化 利用MagCore Compact 核酸抽提仪（芮宝生医股份公司，台湾），以MagCore Genomic DNA Whole Blood Kit（Cat.No.MGB400-04）试剂盒提取全血基因组DNA，取DNA 样本2 μL 用NanoDrop 测定DNA纯度和浓度，确保OD260/OD280＞1.8 至2.0 之间。
1.2.2 TaqMan® 荧光探针检测及SNP 基因分型 3 个SNP 基因型的探针序列及基因信息见表1。反应体系是由20×，40×，80×TaqMan® Genotyping Assay以及TaqMan® Genotyping Master Mix，nuclease-free 水所组成。标准的PCR 反应体系的建立应当为5 μL 体系/孔（384 孔PCR 反应板）；10 μL 体系/孔（96 孔PCR 反应板），按照标准建立反应体系。采用安捷伦mx3000p™序列检测系统（Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA）利用VIC® 和FAM™两个荧光检测通道进行基因变异检测。绘制位基因分型/SNP 实时荧光定量散点分布图，并进行等位基因分型/SNP 实时荧光定量最终结果判定[16-18]。
表1 探针序列及基因信息
Table 1 Probe sequence and gene information
基因SNP 编号Cytogenetic Band 编码NCBI 基因区位编码 序列ABCG8：rs118875342p2144066247GCTGCCGAAAGGGGCCACTCCCCAG[C/G]ATACCTCGGTGAGTGAGCAATGGGA BChE：rs18032743q26.1165555125ACCCGATTCTCTGCAACAAAGATGG[C/T]AAAGTTTGCAAGGAGTGAAAATCAT BChE：rs11266803q26.1165491280AATCCTGCTTTCCACTCCCATTCTG[C/T]TTCATCAATATTTCCTGTAAAATAT
1.2.3 BChE 基因2 个多态位点与胆囊结石发病风险分析 为了分析BChE rs1126680 以及rs1803274 等位基因基因型与胆囊结石疾病的临床特征相关性，采用二元Logistic 回归分析的方法进行相关评估。关于crude odds ratio 的计算，以是否发生胆囊结石疾病作为因变量，而rs1126680以及rs1803274 的基因分型则作为独立变量。通过Logistic 回归分析将等位基因的分型数据与胆囊结石疾病的发生作为独立危险因素进行建模判断，更进一步的将胆囊结石的发生通过危险分层的方法与年龄，性别，BMI 进行确定与调整。
1.3 统计学处理
所有的生化指标以及基因表达数据均采用SPSS 13.0软件进行统计分析。对计量资料的组间比较使用t检验。等位基因频率计算采用的是直接计数方法，采用Pearson χ²检验或者Fisher's确切分析。使用Hardy-Weinberg平衡以及各等位基因型样本大小的差异。采用二元Logistic回归分析的方法进疾病危险因素评估。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 资料分析
胆囊结石疾病组与健康人群除在血液中，低密度脂蛋白（LDLC）与高密度脂蛋白（HDLC）存在明显差异（P=0.028、P=0.015），其余临床指标的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。胆囊结石患者组平均年龄为（46.1±9.2）岁，健康对照组平均年龄为（53.2±5.6）岁，两者之间差异无统计学意义（P=0.267）。其中胆囊结石患者组（男72例，女99例）和健康对照组（男51例，女74例）性别差异无统计学意义（P=0.905），组间具有可比性（表2）。等位基因位点基因频率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律（χ²=0.641，P＞0.05），选择的样本具有群体代表性。
表2 受试者临床特征分析
Table 2 The clinical features of the studied subjects
项目胆囊结石疾病组（n=171）健康对照组（n=125）P性别[n（%）]男72（42.1）51（40.8）0.905女99（57.9）74（59.2）年龄（岁，images/BZ_18_1374_416_1404_468.png±s）46.1±9.253.2±5.60.267 BMI（kg/m2，images/BZ_18_1374_416_1404_468.png±s）24.9±3.124.6±2.90.889 AST（U/L，images/BZ_18_1374_416_1404_468.png±s）34.07±17.830.5±20.40.668 ALT（U/L，images/BZ_18_1374_416_1404_468.png±s）33.2±19.329.2±21.60.867 LDLC（mg/dL，images/BZ_18_1374_416_1404_468.png±s）130.7±35.1113.3±28.90.015 HDLC（mg/dL，images/BZ_18_1374_416_1404_468.png±s）46.8±10.551.8±12.00.028
2.2 ABCG8 rs11887534，BChE rs1803274 以及rs1126680 的等位基因频率分布
TaqMan®探针基因分型结果显示，3个标签SNP成功分型，并且每个标签SNP的分型成功率99.3%（图1）。ABCG8基因（D19H）rs11887534作为阳性对照与文献报道的结果一致[46]。BChE rs1803274（P=1.312×10-15）多态性与胆囊结石疾病的发生存在相关性。与对照组相比随着rs1803274杂合子等位基因的增加，人群患胆囊结石疾病的风险将会增加。然而肥胖相关基因BChE rs1126680（P=0.616）与胆囊结石疾病无关（表3-4）。
2.3 BChE rs1803274 与胆囊结石临床指标的关联性分析
对胆囊结石受试组各等位基因的基因表型，也就是携带纯合子CC，杂合子CT和纯合子TT基因型的BChE rs1803274的相关数据进行关联分析。通过Logistic回归分析将等位基因的分型数据与胆囊结石疾病的发生作为独立危险因素进行建模判断，更进一步的将胆囊结石的发生通过危险分层的方法与年龄，性别和BMI进行确定与调整。BChE rs1803274杂合子CT突变可以作为胆囊结石疾病发病的独立遗传风险因素。Logistic回归分析的建模与结果表明，在女性人群中BChE rs1803274杂合子CT基因型将比纯合子CC及纯合子TT存在更高的胆囊结石疾病的发病风险（95% CI=0.237～0.772，P=0.009）。
图1 基因分型散点图 A：rs11887534 分型；B：rs1803274 分型；C：rs1126680 分型
Figure 1 Scatter plots of genotyping A:The rs11887534;B:The rs1803274;C:The rs1126680
表3 目标等位基因SNP 信息
Table 3 Information of the target alleles
基因名称等位基因NCBI SNP 编号 频率分布BChECC，CT，TTrs180327490:167:39 BChECC，CT，TTrs11266803:293:0 ABCG8：D19H CC，CG，GGrs118875340:286:10
表4 胆囊结石患者目标基因SNP 突变频率[n（%）]
Table 4 Frequency of mutation of the SNPs of the target genes in patients with gallstones[n (%)]
基因名称胆囊结石疾病组（n=171）健康对照组（n=125）P BChE：rs1803274 CT 63（36.8）104（83.2）1.312E-15 CC+TT108（63.2）21（16.8）BChE：rs1126680 CT169（98.8）124（99.2）0.616 CC+TT 2（1.2）1（0.8）ABCG8：D19H CG10（5.8）0（0）0.006 GG161（94.2）125（100.0）
3 讨论
胆囊结石疾病在欧美发达地区是非常普遍的一种消化系统疾病，和亚洲及非洲人群相比，其发病率更高[1]。这种差异被认为可能与饮食习惯和遗传因素有关[19-22]。在296例受试者中，包括171例胆结石受试者以及125例健康对照样本中，随着BChE基因rs1803274突变，胆囊结石疾病的发病风险明显增加。rs1803274杂合子CT在贵州省汉族受试人群中与胆囊结石发病相关。作为阳性对照，所有ABCG8 D19H的突变与临床情况类似于以前的相关报道[23]，这也同时证明了实验数据的可靠性。本研究还比较了胆囊结石患者与健康对照组的相关临床特征，胆囊结石患者组的LDLC均明显高于对照组，然而胆囊结石患者组的HDLC则明显低于健康组。
胆囊结石的形成是受多基因调控的复杂过程，该疾病受到遗传和环境的双重影响，是一种代谢紊乱综合征。胆结石形成的遗传易感、危险因素主要包括年龄，性别，肥胖，以及特定药物的使用[24]。大量研究已确立了BChE与异常的脂肪代谢具有重要关联。这种联系在糖尿病患者、脂肪肝患者和超重患者中尤为明显，表现为血清总胆碱酯酶均升高。Cucuianu等[12]报道2型糖尿病体质量超重的患者，其血清BChE显著升高，并且提出BChE对血清胰岛素、游离脂肪酸和C肽的表达具有明显的调控作用。该研究还指出糖尿病疾病模型犬血清BChE水平显著升高，合并肥胖的犬血清BChE含量进一步增加。糖尿病模型家兔BChE高于对照组，给予抗胆碱酯酶药溴化斯的明治疗后，空腹血糖含量明显下降[25]。研究[26]提出血清BChE升高是脂肪肝的突出生化指标的观点，血清中BChE指标更加能够反映肝脏对脂肪代谢能力。随着我国经济的飞速发展，中国人群饮食总体热量逐年增高[27]。人群的运动量开始减少，脂肪消耗也减少，从而极易造成脂肪堆积，引发高脂血症和肥胖症[28]。值得注意的是，在糖尿病合并高脂血症的患者中，体内脂肪酸合成和转化增加，肝细胞内的脂肪增多，脂肪变性的肝细胞数量增加，导致肝中酰基辅酶A大量累积，其进一步代谢产物可产生大量酰基胆碱，而正是酰基胆碱成为血清ChE的主要底物。所以血清中BChE含量升高可能是由于大量底物诱导肝合成酶增加而形成[29]。BChE作为肥胖相关基因，其表达出现异常提示着紊乱的脂质代谢过程，这与胆囊结石疾病的发生有着极强的联系[30]。
BChE基因在脂质代谢及代谢紊乱综合征的发生发展过程中扮演极为重要的角色，但是，BChE基因与胆囊结石疾病的联系及该基因SNP突变对胆囊结石产生的相关研究却仍属空白。本研究通过病例对照研究探讨贵州地区汉族人群肥胖基因BChE基因SNP位点与胆囊结石疾病发病风险的相关性。选取171例贵州省汉族胆囊结石患者和125例健康对照者入组。采用TaqMan®探针技术，对肥胖相关基因BChE rs1126680、rs1803274进行基因分型。发现随着BChE rs1803274 SNP突变，人群患胆囊结石疾病的风险将会升高，更加增加了女性罹患胆囊结石的发病风险。然而肥胖相关基因BChE rs1126680为与胆囊结石疾病发病风险无意义的突变位点。本研究为胆囊结石的成因研究及胆囊结石遗传易感性检测相关研究提供了最新的工作基础。
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